shRNA表達質(zhì)粒對柯薩奇病毒B3的抑制作用.pdf

1、目的：病毒性心肌炎及擴張性心肌病嚴重危害人類健康，發(fā)病率近十年來呈不斷上升的趨勢。柯薩奇病毒B組(coxsackievirusgroupB，CVB)是引起此類疾病的主要病原體，以CVB3最為常見。CVB3屬于小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬，為無包膜的單鏈正股RNA病毒?；蚪M全長約7400bp，包含一個開放讀碼框(ORF)及其兩側(cè)的非翻譯區(qū)(UTR)。病毒基因組本身具有mRNA活性，編碼產(chǎn)生一系列病毒復制所需的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1

2、-VP4組成病毒衣殼，P2A及P2C分別為病毒編碼的蛋白酶。近年來研究者從不同切入點對CVB3核酸、編碼蛋白及致病的分子機制進行了大量探索，但目前應用各種抗病毒藥物、疫苗以及反義寡核苷酸技術(shù)等防治方法均未取得滿意效果。 1998年，F(xiàn)ire等首先在線蟲中發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)分子可以引發(fā)序列特異性同源RNA降解，這種現(xiàn)象被稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)。其機

3、制為：dsRNA在胞漿內(nèi)經(jīng)Dicer(RNase-III家族的一種酶)切割產(chǎn)生長21-23nt的小干擾RNA(smallinterfereRNA，siRNA);siRNA與多組相關(guān)蛋白結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilencecomplex,RISC)，以siRNA的一條單鏈為模板識別并切割與之互補的靶RNA，從而干擾靶RNA的表達。RNAi在進化上是一種古老的防御機制，廣泛存在于真菌、植物、動物等多種生物體中

4、，作為核酸水平的“免疫系統(tǒng)”，能夠保護生物體基因組免受外源核酸分子侵襲，如抗病毒、抵抗轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座等；此外，還具有一定的基因表達調(diào)節(jié)作用。RNAi技術(shù)具有高效性(比反義寡核苷酸高兩個數(shù)量級)、特異性(對非同源基因沒有影響)，成為近年來發(fā)展起來的一項新的分子生物學技術(shù)。 細胞內(nèi)直接導入人工合成的siRNA，或通過內(nèi)源性表達產(chǎn)生21-23nt的RNA片段，均能實現(xiàn)序列特異性RNA干擾作用。化學合成及體外轉(zhuǎn)錄方法獲得的siRNA成本高

5、、穩(wěn)定性差；而載體介導的RNAi能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生功能性siRNA，從而克服上述缺點。設(shè)計包含siRNA模板的序列克隆入RNA聚合酶Ⅲ(p01Ⅲ)轉(zhuǎn)錄單元，通過polⅢ啟動子(U6，H1)驅(qū)動能夠合成小的非編碼RNA，如短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)。shRNA經(jīng)細胞內(nèi)加工形成功能性siRNA,使得應用DNA質(zhì)?；虿《狙苌妮d體在細胞內(nèi)實現(xiàn)RNAi成為可能?；诖?，本研究以CVB3為對象，在基因組中選擇靶點，構(gòu)

6、建了編碼產(chǎn)生shRNA的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，觀察其抗病毒效用，初步探討其對柯薩奇病毒復制的抑制作用及RNAi用于防治CVB3感染性疾病的可能性。 方法：1在CVB3基因組ORF中選擇三個靶點(P1D、P2A、P2C)，設(shè)計合成編碼產(chǎn)生shRNA的DNA寡核苷酸單鏈，退火形成互補雙鏈后克隆到載體pSuperEGFPl(以下簡稱pSE)中H1啟動子下游，構(gòu)建序列特異性shRNA真核表達質(zhì)粒pSE-1D、pSE-2A和pS

7、E-2C。 2按試驗分組以陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細胞。試驗分四組：重組質(zhì)粒pSE-1D轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒pSE-2A轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒pSE-2C轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒pSE轉(zhuǎn)染組。其中質(zhì)粒pSE組為對照，另設(shè)未轉(zhuǎn)染的正常細胞及病毒感染細胞對照組，每組4復孔。激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，判斷轉(zhuǎn)染效率。 3分別于轉(zhuǎn)染前1h及轉(zhuǎn)染后5h以100TCID50CVB3感染細胞，觀察細胞病變效應；提取細胞總RNA，采用半定量

8、RT-PCR法擴增各組病毒RNA片段，以GAPDH作為內(nèi)參照，用Quantityone軟件對電泳譜帶進行半定量分析，測定病毒RNA與內(nèi)參GAPDH的累積光密度(IOD)，以病毒RNA與內(nèi)參GAPDH的累積光密度比值(U/G)表示RNA的相對表達水平。 4病毒感染后40小時提取細胞總蛋白，通過Westernblot檢測病毒蛋白表達水平，以Quantityone軟件分析病毒vP2蛋白與內(nèi)參β-actin的累積光密度比值(V/A)，作

9、為各組VP2的相對表達量。 5收集各組病變細胞，反復凍融三次，離心取上清液，以微量法進行病毒效價滴定，Reed-Muench法計算病毒滴度。結(jié)果：1測序結(jié)果證實CVB3序列特異性shRNA真核表達質(zhì)粒pSE-1D、pSE-2A、pSE-2C構(gòu)建正確。 2轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)可見綠色熒光蛋白表達，判斷轉(zhuǎn)染效率約50％。 3以半定量RT-PCR測定病毒基因片段UTR與內(nèi)參GAPDH的累積光密度IOD比值(U/G)。轉(zhuǎn)染前1h

10、感染病毒，pSE、pSE-1D、pSE-2C、pSE-2A組U/G比值分別為：1.9210±0.04395、1.8419±0.0436、1.6598±.0584、1.668±0.0144。其中pSE-2A組、pSE-2C組與pSE對照組比較病毒核酸減少均有統(tǒng)計意義(P＜0.05)；pSE-1D組與pSE組比較病毒核酸含量無明顯差異(P＞0.05)；pSE-2A組、pSE-2C組與pSE-1D組比較病毒核酸減少，均有統(tǒng)計意義(P＜0.05

11、)；pSE-2A組比pSE-2C組病毒核酸相對含量減少無顯著差異(P＞0.05)。 轉(zhuǎn)染后5h感染病毒，pSE、pSE-1D、pSE-2C、pSE-2A組U/G比值分別為：1.7000±0.0658、1.6816±0.0514、1.2520±0.0225、0.9231±0.0162。其中pSE-2A組、pSE-2C組與pSE組比較病毒核酸減少(P＜0.05)；pSE-2A組、pSE-2C組與pSE-1D組比較病毒核酸減少，均有統(tǒng)

12、計意義(P＜0.05)；pSE-1D組與pSE對照組比較病毒核酸無顯著減少；pSE-2A組比pSE-2C組病毒核酸減少，有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。 4Westernblot法測定病毒VP2蛋白表達情況，以β-actin作為內(nèi)參照進行半定量分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染前1h感染病毒，pSE、pSE-1D、pSE-2C、pSE-2A組V/A比值分別為：1.0329±0.3242、1.0062±0.0482、0.9534±0.0271、0.907

13、9±0.02121。其中pSE-2A組、pSE-2C組與pSE對照組比較病毒蛋白含量降低，有統(tǒng)計意義(P＜0.01)；而pSE-1D組與pSE對照組比較病毒蛋白表達下降無顯著差異(P＞0.05)；pSE-2A組、pSE-2C組與pSE-1D組比較病毒蛋白含量降低，均有統(tǒng)計意義(P＜0.05),pSE-2A組與pSE-2C組兩組間比較無顯著差異(p＞0.05)。 轉(zhuǎn)染后5h感染病毒，pSE、pSE-1D、pSE-2C、pSE-2A

14、組V/A比值分別為：1.0576±0.0248、0.9672±0.0266、0.8761±0.0196、0.8838±0.0196。其中pSE-1D組、pSE-2A組、pSE-2C組與pSE對照組比較病毒蛋白含量降低均有統(tǒng)計意義(P＜0.01)；pSE-2A組、pSE-2C組與pSE-1D組比較病毒蛋白含量降低，均有統(tǒng)計意義(P＜0.01)。pSE-2A組與pSE-2C組組間比較病毒蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)。 5轉(zhuǎn)染前

15、1h感染病毒，測定各組病毒效價分別為：pSE組6.1825±0.4725、pSE-1D組6.1400±0.1667、pSE-2C組5.600±0.3224、pSE-2A組5.5425±0.0850。其中pSE-2A組、pSE-2C組與pSE對照組比較病毒滴度分別下降4.14、3.82倍(P＜0.05)，而pSE-1D組與pSE對照組比較病毒滴度下降無顯著差異；pSE-2A組、pSE-2C組與pSE-1D組比較病毒滴度降低，均有統(tǒng)計意義(

16、P＜0.05)，pSE-2A組與pSE-2C組兩組間比較無顯著差異(p＞0.05)。 轉(zhuǎn)染后5h感染病毒，測定各組病毒效價分別為：pSE組6.1250±0.3676、pSE-1D組5.6675±0.2357、pSE-2C組5.5850±0.4827、pSE-2A組5.5488±0.2136。其中pSE-2A、pSE-2C組與pSE對照組比較病毒滴度分別下降3.76、3.47倍，有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，而pSE-1D組與pSE

17、對照組比較病毒滴度下降無顯著差異(p＞0.05)；pSE-1D組、pSE-2A組、pSE-2C組三組間兩兩比較無顯著差異(p＞0.05)。 結(jié)論：1成功構(gòu)建了三個靶向CVB3基因組的shRNA真核表達質(zhì)粒pSE-1D、pSE-2A、pSE-2C。 2質(zhì)粒pSE-2C及pSE-2A有抑制CVB3感染及復制的作用，但尚不能完全阻止病毒感染復制；質(zhì)粒pSE-1D對CVB3感染無明顯抑制作用。 3本研究采用質(zhì)粒載體介導R