肝胰腺細小病毒病流行情況初步調查及病原核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究.pdf

1、肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)是引起對蝦疾病的重要病原之一,在病毒分類中屬于細小病毒科(Parvoviridae),濃核病毒亞科(Densovirinae)。主要的對蝦養(yǎng)殖品種都是HPV的自然宿主,在中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)中尤為常見,病毒感染可導致幼蝦死亡或引起矮小殘缺綜合癥(RDS),蟹類等其他甲殼類動物也可攜帶并傳播該病毒。HPV核酸為單鏈線

2、性DNA,基因組大小約6 kb,由單一核衣殼蛋白包裹。病毒粒子無囊膜,正二十面體形,直徑22～23 nm?；蚪M有3個開放閱讀框(ORF),編碼2個非結構蛋白和1個結構蛋白——核衣殼蛋白。目前,GenBank數據庫中已提交的HPV全基因序列有5條,分別為泰國株(DQ002873)、澳大利亞株(DQ458781)、印度株(FJ410797)、中國株(GU371276)和韓國株(JN082231)。HPV不同地理株的基因序列分析數據表明HP

3、V基因組存在較多的遺傳變異情況。
　　目前,針對HPV的檢測方法主要采用國際上通用的組織病理學觀察,常規(guī)PCR檢測法等;已報道的real-time PCR檢測法,由于引物及探針序列的差異,不適用于HPV中國地理株。因此,本研究以HPV中國株基因序列為主要依據,設計引物和TaqMan探針,建立real-time PCR檢測法,并應用于樣品檢測。本實驗室已經建立了HPV核衣殼蛋白的原核重組表達系統(tǒng),在此基礎上,依據單鏈核酸具有功能性天

4、然構象與核衣殼蛋白存在特異性識別能力并產生選擇性裝配機制這一特性,運用指數富集的配基系統(tǒng)進化(SELEX)技術,進行HPV核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究。
　　本研究的主要內容包括:
　　1、樣品調查與分析。在2011年5月至2012年10月期間,在山東半島及環(huán)渤海主要對蝦養(yǎng)殖地區(qū)進行了流行病學調查,采集數百份樣品,主要運用了現場診斷技術,病原檢測試劑盒,組織病理學觀察,普通PCR法,real-time PCR法等手段,進行病

5、原檢測。對于疫病流行病學調查及疾病的防控和預警提供了有力的科學依據,具有重要的意義。
　　2、HPV中國株real-time PCR檢測方法建立和應用。根據HPV中國株基因組序列,設計了一對引物及TaqMan探針,進行real-time PCR反應體系優(yōu)化、特異性分析、標準曲線構建及靈敏度分析、重復性分析,并應用于樣品檢測。分析結果表明:新建立的HPV real-time PCR檢測法靈敏特異,重復性良好,適合HPV中國株的檢測。

6、臨床應用檢測結果顯示:所檢樣品中,中國明對蝦HPV陽性率高達76％,且具有較高的病毒拷貝數,凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)HPV陽性率很低,且檢出的病毒拷貝數也低;HPV強陽性的樣品,其養(yǎng)殖水體中的其他環(huán)境生物甚至養(yǎng)殖海水中也檢出HPV。
　　3、HPV核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究。利用AKTA explorer100完成重組表達的HPV核衣殼蛋白的純化、復性,使用超聲隨機打斷的方法構建HPV基因組隨機ds