肝胰腺細(xì)小病毒病流行情況初步調(diào)查及病原核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究.pdf

1、肝胰腺細(xì)小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)是引起對(duì)蝦疾病的重要病原之一,在病毒分類中屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae),濃核病毒亞科(Densovirinae)。主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種都是HPV的自然宿主,在中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)中尤為常見,病毒感染可導(dǎo)致幼蝦死亡或引起矮小殘缺綜合癥(RDS),蟹類等其他甲殼類動(dòng)物也可攜帶并傳播該病毒。HPV核酸為單鏈線

2、性DNA,基因組大小約6 kb,由單一核衣殼蛋白包裹。病毒粒子無(wú)囊膜,正二十面體形,直徑22～23 nm?；蚪M有3個(gè)開放閱讀框(ORF),編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和1個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白——核衣殼蛋白。目前,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的HPV全基因序列有5條,分別為泰國(guó)株(DQ002873)、澳大利亞株(DQ458781)、印度株(FJ410797)、中國(guó)株(GU371276)和韓國(guó)株(JN082231)。HPV不同地理株的基因序列分析數(shù)據(jù)表明HP

3、V基因組存在較多的遺傳變異情況。
　　目前,針對(duì)HPV的檢測(cè)方法主要采用國(guó)際上通用的組織病理學(xué)觀察,常規(guī)PCR檢測(cè)法等;已報(bào)道的real-time PCR檢測(cè)法,由于引物及探針序列的差異,不適用于HPV中國(guó)地理株。因此,本研究以HPV中國(guó)株基因序列為主要依據(jù),設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,建立real-time PCR檢測(cè)法,并應(yīng)用于樣品檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了HPV核衣殼蛋白的原核重組表達(dá)系統(tǒng),在此基礎(chǔ)上,依據(jù)單鏈核酸具有功能性天

4、然構(gòu)象與核衣殼蛋白存在特異性識(shí)別能力并產(chǎn)生選擇性裝配機(jī)制這一特性,運(yùn)用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù),進(jìn)行HPV核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究。
　　本研究的主要內(nèi)容包括:
　　1、樣品調(diào)查與分析。在2011年5月至2012年10月期間,在山東半島及環(huán)渤海主要對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,采集數(shù)百份樣品,主要運(yùn)用了現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù),病原檢測(cè)試劑盒,組織病理學(xué)觀察,普通PCR法,real-time PCR法等手段,進(jìn)行病

5、原檢測(cè)。對(duì)于疫病流行病學(xué)調(diào)查及疾病的防控和預(yù)警提供了有力的科學(xué)依據(jù),具有重要的意義。
　　2、HPV中國(guó)株real-time PCR檢測(cè)方法建立和應(yīng)用。根據(jù)HPV中國(guó)株基因組序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)引物及TaqMan探針,進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、特異性分析、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及靈敏度分析、重復(fù)性分析,并應(yīng)用于樣品檢測(cè)。分析結(jié)果表明:新建立的HPV real-time PCR檢測(cè)法靈敏特異,重復(fù)性良好,適合HPV中國(guó)株的檢測(cè)。

6、臨床應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果顯示:所檢樣品中,中國(guó)明對(duì)蝦HPV陽(yáng)性率高達(dá)76％,且具有較高的病毒拷貝數(shù),凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)HPV陽(yáng)性率很低,且檢出的病毒拷貝數(shù)也低;HPV強(qiáng)陽(yáng)性的樣品,其養(yǎng)殖水體中的其他環(huán)境生物甚至養(yǎng)殖海水中也檢出HPV。
　　3、HPV核酸與核衣殼蛋白親和篩選探究。利用AKTA explorer100完成重組表達(dá)的HPV核衣殼蛋白的純化、復(fù)性,使用超聲隨機(jī)打斷的方法構(gòu)建HPV基因組隨機(jī)ds