中樞過表達ACE2降低膽堿能突觸傳遞機制在改善高血壓中的作用研究.pdf

1、高血壓（Hypertension）一直是心血管領域的研究重點，因其并發(fā)腦卒中、冠心病和心力衰竭等嚴重心血管疾病，嚴重影響人類健康。血壓升高和交感神經(jīng)活動亢進是高血壓心血管功能紊亂的主要特征，并與高血壓并發(fā)癥的預后發(fā)展密切相關。頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（RVLM）是維持基礎血壓和調(diào)控交感輸出的關鍵中樞，其結(jié)構和功能異常是高血壓病理改變的一個重要機制。研究表明RVLM膽堿能突觸傳遞（Cholinergic synaptic transmission

2、）在自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）中是明顯增強的，因此其增強機制在誘發(fā)SHR的血壓升高和交感神經(jīng)過度興奮中具有重要作用。如何有效降低RVLM內(nèi)膽堿能突觸傳遞對改善高血壓心血管功能紊亂的機制策略研究具有重要意義。
　　眾所周知，腎素—血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)的異?；顒优c高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關。ACE2-Ang(1-7)-MAS軸是近年研究發(fā)現(xiàn)的RAS新途徑，作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE

3、）的同系物，ACE2可以催化AngⅡ生成Ang(1-7），Ang(1-7)可以特異性作用于G蛋白偶聯(lián)Mas受體產(chǎn)生與AngII效應相反的心血管保護作用，因此ACE2-Ang(1-7)-MAS軸可能會成為治療高血壓的一個潛在新靶點。有研究證實SHR的RVLM內(nèi)過表達ACE2可以引起長效的降血壓效應，但目前并不清楚ACE2是否通過減弱 RVLM內(nèi)膽堿能途徑從而產(chǎn)生改善高血壓的作用？因此本研究的主要目標是明確ACE2過表達對高血壓大鼠RVLM

4、內(nèi)膽堿能突觸傳遞的作用及其可能機制。
　　炎癥刺激誘導的氧化應激水平增強是RVLM神經(jīng)元興奮性增強的一個重要機制。AngⅡ是一種前炎癥因子，有顯著的促炎作用，AngⅡ的增加通過激活膠質(zhì)細胞NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子活性而增強炎癥因子的表達并誘導產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介導的氧化應激。因此，也將明確ACE2過表達是否具有抑制高血壓大鼠RVLM內(nèi)炎癥因子合成的作用。
　　方法：本

5、實驗通過采用慢病毒載體將ACE2（Lenti-ACE2）過表達于SHR及WKY大鼠RVLM后，每周在相同時間段運用大鼠尾動脈無創(chuàng)性血壓監(jiān)測系統(tǒng)，監(jiān)測其清醒狀態(tài)下血壓和心率的變化；高效液相色譜法檢測24小時尿中去甲腎上腺素（NE）含量，從而明確交感神經(jīng)活動的活性；Western-blot方法檢測RVLM內(nèi)ACE2基因轉(zhuǎn)染后ACE2的表達情況等來驗證ACE2的轉(zhuǎn)染效率。在ACE2過表達的大鼠上，對乙酰膽堿及其受體系統(tǒng)相關指標進行了檢測。轉(zhuǎn)染

6、ACE2六周后，通過用試劑盒檢測RVLM微透析液中乙酰膽堿（ACh）的含量，來觀察過表達ACE2后ACh含量有無明顯變化；用Western-blot檢測 MasR的表達變化，明確 ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的變化，并通過Western-blot檢測囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體（VAChT）、ACh作用受體M2R、氧化應激相關酶NOX4和SOD1蛋白表達情況；用ELISA試劑盒檢測細胞因子TNFα，IL-1β，IL-6的含量變化；從整體動

7、物水平，在大鼠RVLM內(nèi)急性微量注射乙酰膽堿阻斷劑阿托品，觀察其對大鼠血壓、心率、腎交感神經(jīng)放電活動等指標的影響，從而明確其受體功能的變化。
　　結(jié)果：1．RVLM內(nèi)過表達ACE2對血壓和心率的影響
　　本實驗分為WKY，SHR-GFP，SHR-ACE2三組。RVLM內(nèi)未轉(zhuǎn)染ACE2之前，SHR組與WKY組血壓及心率存在顯著差異(P<0.05)。第1周（未轉(zhuǎn)染之前）SHR大鼠的MAP（182±7mmHg）和HR[351±16

8、beats per min(bpm)]均明顯（P<0.05）高于正常血壓對照WKY大鼠的MAP（138±5mmHg）和HR（321±29bpm）。SHR分別轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組和Lenti-GFP組轉(zhuǎn)染后前3周收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均無明顯差別。轉(zhuǎn)染后第4周SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組的MAP（149±3mmHg）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP的MAP（181±8mmHg）。SHR分別轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組和Le

9、nti-GFP組轉(zhuǎn)染后前3周心率無明顯變化，SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2第4周開始出現(xiàn)降低，但無統(tǒng)計學差異，第5周開始SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組的心率（289±11bpm）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組的心率（349±15bpm）。
　　2．SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染ACE2后對24小時尿液中的NE含量的影響
　　分別對WKY，SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP和Lenti-ACE2后6周，用高效液相色譜法進行24小

10、時尿液中去甲腎上腺素含量測定，觀察各組交感活動的變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組后6周24小時尿液中去甲腎上腺素含量（0.1664±0.021μg/24h）顯著高于WKY組（0.042±0.008μg/24h）。而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周24小時尿液中去甲腎上腺素含量（0.046±0.004μg/24h）顯著低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相比無差異。
　　

11、3．SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染ACE2對ACE2-Ang(1-7)-Mas軸表達的作用
　　結(jié)果顯示，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組ACE2/α-tubulin表達（0.088±0.009）顯著低于正常WKY組ACE2/α-tubulin（0.147±0.018），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周ACE2/α-tubulin（0.122±0.013）顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相

12、比無差異。SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周，ACE2的表達明顯上調(diào)，與降壓的效果相對應。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組MasR/α-tubulin表達（0.482±0.008）顯著低于正常WKY組MasR/α-tubulin（0.861±0.015），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周MasR/α-tubulin（0.877±0.012）顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相

13、比無差異。
　　4．RVLM內(nèi)過表達ACE2對RVLM內(nèi)乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組6周RVLM微透析液中ACh濃度（12.97±1.672μg/mL）顯著（P<0.05）高于WKY組（5.69±0.517μg/mL），SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周RVLM微透析液中ACh含量（7.017±0.932μg/mL）顯著（P<0.05）低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，但仍然稍高

14、于正常WKY組。
　　5．RVLM內(nèi)表達ACE2對RVLM內(nèi)VAChT、M2R、NOX4和SOD1蛋白表達的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組VAChT/α-tubulin表達（0.1139±0.016）顯著（P<0.05）低于WKY組VAChT/α-tubulin（0.061±0.009），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周VAChT/α-tubulin（0.066±0.008）顯著（P<0.0

15、5）高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相比無差異。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后NOX4/α-tubulin顯著低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與WKY組相比無差異。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后，SOD1/α-tubulin顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與WKY組相比無差異。M2R/α-tubulin三組比較無差異。6．RVLM過表達ACE2對M型乙酰膽堿受體介導的緊張性心血管活動

16、的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組6周RVLM核團微量注射硫酸阿托品(M型乙酰膽堿受體阻斷劑)2 nmol后的MAP降低程度（55±4 mmHg）顯著（P<0.05）高于WKY組（15±1 mmHg）。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周RVLM微量注射硫酸阿托品2 nmol后的MAP降低程度（23±7mmHg）顯著（P<0.05）低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，但仍然稍高于正常WKY組。而WKY組HR降低

17、程度（10±3bpm），SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組HR降低程度（12±5bpm）和大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組HR降低程度（17±5bpm）無顯著差異。
　　7．SHR RVLM過表達ACE2后對炎癥細胞因子含量變化的影響
　　結(jié)果顯示，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組TNFa，IL-1β含量顯著（P<0.05）低于正常WKY組，而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周顯著（P<0.05）高于SHR大