ACE2-Ang1-7-Mas軸改善高血壓交感中樞NOS脫偶聯(lián)的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　原發(fā)性高血壓是目前不能明確發(fā)病原因的高血壓，其發(fā)病比例超過(guò)高血壓總量的95％以上，而且其多種并發(fā)癥如腦卒中、心力衰竭、高血壓性腎損害和眼底病變等長(zhǎng)期威脅著人類(lèi)的健康，是目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。大量研究顯示交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的增加與高血壓的形成、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控中樞位于腦干的頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(RVLM)，它是維持正常動(dòng)脈血壓和交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的關(guān)鍵部位。近年來(lái)研究表明，RVLM氧化應(yīng)激是

2、高血壓交感輸出亢進(jìn)的重要病理機(jī)制之一，但RVLM氧化應(yīng)激的來(lái)源和誘發(fā)機(jī)制尚不明確。
　　研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶(NOS)脫偶聯(lián)是引發(fā)氧化應(yīng)激增強(qiáng)的一個(gè)重要原因。NOS脫偶聯(lián)是指具有正常生物學(xué)功能的NOS二聚體解聚成單體的現(xiàn)象，而四氫生物蝶呤(BH4)是維持NOS二聚體及其功能必不可少的輔因子。脫偶聯(lián)的NOS不能催化一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，但仍能夠傳遞來(lái)自還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活化產(chǎn)生的電子，使O2形成超

3、氧陰離子(·O2-)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激的水平。因此，我們的主要研究目標(biāo)是明確NOS脫偶聯(lián)是否參與了高血壓病理狀態(tài)下RVLM的氧化應(yīng)激及其在高血壓心血管功能調(diào)節(jié)中的作用和意義，并探索如何改善高血壓交感中樞NOS脫偶聯(lián)。
　　血管緊張素1-7(Ang1-7)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的成員之一，由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)催化、內(nèi)切酶和羧肽酶酶切血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)羧基端的苯丙氨酸后形成，在外周循環(huán)系統(tǒng)中，通過(guò)作用于其特異

4、性Mas受體產(chǎn)生與AngⅡ相互制衡的心血管保護(hù)效應(yīng)，對(duì)心血管活動(dòng)穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Ang1-7對(duì)心血管活動(dòng)也具有重要的調(diào)控作用，但能否通過(guò)改善RVLM內(nèi)NOS脫偶聯(lián)降低氧化應(yīng)激從而發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)并不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在WKY大鼠RVLM急性灌注AngⅡ能夠抑制1型三磷酸鳥(niǎo)苷酸(GTP)環(huán)化水解酶(GTPCH1)的表達(dá)，從而引起神經(jīng)元型NOS(nNOS)脫偶聯(lián)，GTPCH1是BH4合成的

5、限速酶。因此提出本實(shí)驗(yàn)的假設(shè)，即在自發(fā)高血壓大鼠(SHR)RVLM中Ang1-7能夠通過(guò)促進(jìn)GTPCH1的表達(dá)從而改善nNOS脫偶聯(lián)，進(jìn)而減少氧化應(yīng)激降低血壓。
　　在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)以下幾方面開(kāi)展研究工作:第一，我們直接檢測(cè)SHR和正常血壓的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠RVLM內(nèi)NOS二聚體/單體的比值、GTPCH1的表達(dá)水平和BH4的含量，初步探索SHR RVLM內(nèi)是否存在NOS脫偶聯(lián)增加的現(xiàn)象;第二，我們通過(guò)RVL

6、M腺病毒過(guò)表達(dá)GTPCH1進(jìn)一步探索上調(diào)BH4含量，明確增加BH4的含量是否可以改善SHR RVLM內(nèi)的NOS脫偶聯(lián)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低交感神經(jīng)興奮性和血壓;第三，我們通過(guò)RVLM慢病毒過(guò)表達(dá)ACE2探索上調(diào)Ang1-7的含量是否能夠改善NOS脫偶聯(lián)，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮性和血壓;最后，我們以CATH.a神經(jīng)元為模型，在細(xì)胞水平探索了環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是否參與了ACE2/Ang1-7/Mas軸改善NOS脫偶聯(lián)的過(guò)程。

7、>　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物模型為SHR和WKY大鼠，細(xì)胞模型為CATH.a神經(jīng)元。通過(guò)無(wú)線遙感監(jiān)測(cè)SHR和WKY大鼠RVLM過(guò)表達(dá)GTPCH1前后的血壓(BP)和心率(HR)變化，記錄時(shí)間為轉(zhuǎn)染前7天至轉(zhuǎn)染后第15天;記錄SHR和WKY大鼠的RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2前后清醒狀態(tài)下的平均動(dòng)脈壓(MAP)和HR，記錄時(shí)間為轉(zhuǎn)染前1周至轉(zhuǎn)染后6周，并監(jiān)測(cè)心血管功能及腎交感神經(jīng)的放電活動(dòng)(RSNA);利用高效液相(HPLC)色

8、譜法檢測(cè)RVLM組織中BH4含量;利用HPLC電化學(xué)法檢測(cè)24-h尿液中去甲腎上腺素(NE)的含量;利用低溫western blot檢測(cè)NOS二聚體的表達(dá)水平;利用常規(guī)western blot檢測(cè)NOS、磷酸化NOS、GTPCH1和ACE2的表達(dá)水平;利用超氧陰離子熒光探針(DHE)檢測(cè)·O2-的含量;利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)RVLM組織及CATH.a細(xì)胞中的AngⅡ、Ang1-7和cAMP的含量。
　　研究結(jié)果：<

9、br>　　1、SHR RVLM內(nèi)nNOS脫偶聯(lián)現(xiàn)象增加
　　發(fā)現(xiàn)SHR的RVLM內(nèi)BH4的含量(0.088±0.032vs0.279±0.056μg/g)、nNOS二聚體/單體的比例（1.00±0.23vs0.06±0.16）、p-nNOS/T-nNOS的比例（1.00±0.09vs0.63±0.08）和GTPCH1的表達(dá)水平（1.00±0.05vs0.7±0.04）均較WKY組明顯減少（P＜0.05）。
　　2、RVLM過(guò)

10、表達(dá)GTPCH1對(duì)心血管活動(dòng)的影響
　　此部分實(shí)驗(yàn)分為4組:WKY-GFP、WKY-GTPCH1、SHR-GFP和SHR-GTPCH1組。
　　2.1、SHR RVLM過(guò)表達(dá)GTPCH1降低血壓和交感神經(jīng)興奮性
　　SHR和WKY大鼠RVLM過(guò)表達(dá)GTPCH1前1周記錄MAP分別為102±4mmHg和146±5mmHg，HR分別為300±23bpm和290±25bpm;過(guò)表達(dá)GTPCH1后第9天SHR-GTPCH1組的

11、MAP與SHR-GFP組比較平均降低15mmHg(P＜0.05)，HR沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)HPLC測(cè)得SHR-GTPCH1組24-h尿中NE含量較SHR-GFP組(1.3±0.05vs1.0±0.04μg)顯著減少(P＜0.05)。
　　2.2、SHR RVLM過(guò)表達(dá)GTPCH1改善nNOS脫偶聯(lián)和氧化應(yīng)激
　　SHR-GTPCH1組nNOS二聚體/單體的比例較SHR-GFP組（1.69±0.12vs0.49±0.05）顯著

12、增加(P＜0.05);SHR-GTPCH1組·O2-的含量較SHR-GFP組(1.6±0.08vs2.3±0.09 A.U.)顯著降低（P＜0.05）。
　　3、RVLM過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)心血管活動(dòng)的影響
　　此部分實(shí)驗(yàn)分為4組:WKY-GFP、WKY-ACE2、SHR-GFP和SHR-ACE2組。
　　3.1 SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2降低血壓和交感神經(jīng)興奮性
　　與對(duì)照SHR-GFP相比，SHR RVLM過(guò)

13、表達(dá)ACE26周后MAP(151±8vs170±13mmHg)、HR(365±27vs389±32bpm)和腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)(RSNA)(25±2vs40±3％)明顯降低(P＜0.05)。
　　3.2 SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2改善NOS脫偶聯(lián)
　　與SHR-GFP組相比，SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2后Ang1-7/AngⅡ的比值(0.40±0.009 vs0.22±0.02)、nNOS二聚體/單體的比值(6.3±1

14、.6 vs3.3±0.4)和GTPCH1的表達(dá)水平(0.24±0.08 vs0.08±0.01)顯著增高(P＜0.05)。
　　3.3 SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2上調(diào)cAMP的含量
　　與SHR-GFP組相比，SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2后cAMP的含量(16.7±1.7 vs12.9±1.8 pmol/mg)顯著增高（P＜0.05）。
　　4、Ang1-7可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量改善NOS脫偶聯(lián)
　

15、　4.1、Ang1-7上調(diào)CATH.a細(xì)胞cAMP的含量和GTPCH1的表達(dá)此部分實(shí)驗(yàn)分為4組:Control、DMSO、cAMP激動(dòng)劑(Forskolin)和Ang1-7組。Ang1-7處理組cAMP的含量(4.8±0.83vs2.19±0.98pmol/mg)和GTPCH1的表達(dá)水平(2.38±0.05vs1.0±0.04)均明顯高于Control組（P＜0.05）。
　　4.2、cAMP抑制劑(Bupivacaine-HCl

16、)可以抑制Ang1-7的作用此部分實(shí)驗(yàn)分4組:Control、DMSO、Bupivacaine-HCl和Bupivacaine-HCl+Ang1-7組。與Control組相比較，Bupivacaine-HC1組cAMP的含量(0.55±0.14vs2.5±0.48pmol/mg)和GTPCH1的表達(dá)水平(0.46±0.02vs1.1±0.006)顯著降低（P＜0.05）;Bupivacaine-HCl+Ang1-7組cAMP的含量(0.