KLF2-RelA比例失衡對(duì)支氣管哮喘患者中性粒細(xì)胞凋亡的影響研究.pdf

1、目的：
　　研究支氣管哮喘患者中性粒細(xì)胞內(nèi)是否存在KLF2/RelA比例失衡及與中性粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系
　　方法：
　　收集健康正常人及輕、中、重度哮喘患者外周血，通過FICOLL淋巴細(xì)胞分離液分離中性粒細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡率，利用RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)KLF2、RelA和Bcl-xlmRNA和蛋白的表達(dá)，利用免疫熒光檢測(cè)KLF2和RelA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位。
　　結(jié)果：

2、
　　1.中性粒細(xì)胞的分離與純度鑒定
　　成功分離外周血中性粒細(xì)胞，經(jīng)Wright-Giemsa染色鑒定后，中性粒細(xì)胞純度達(dá)到95％以上；
　　2.哮喘患者中性粒細(xì)胞凋亡率變化
　　健康對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組中性粒細(xì)胞凋亡率（5.36±0.57、4.45±0.76、2.10±0.25、1.81±0.67）呈降低趨勢(shì)，健康對(duì)照組、輕、中度哮喘組間兩兩比較，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），健康對(duì)照組、輕度哮

3、喘組與重度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,中度哮喘組與重度哮喘組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.哮喘患者KLF2mRNA和蛋白表達(dá)變化及與凋亡的關(guān)系
　　1）KLF2mRNA相對(duì)表達(dá)量：RT-PCR檢測(cè)KLF2mRNA在各組的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)輕、中、重度哮喘組（0.47±0.11、0.75±0.13、1.17±0.28）呈上升趨勢(shì)，輕度哮喘組和中度哮喘組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），

4、中、重度哮喘組間比較差異差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中、重度哮喘組與健康志愿者組（1.52±0.37）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），重度哮喘組與健康志愿者組（1.52±0.37）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）如表3，圖3；
　　2）KLF2蛋白相對(duì)表達(dá)量：Western-blot檢測(cè)KLF2蛋白在各組的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)輕、中、重度哮喘組KLF2蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.050±0.014、0.066±0.025、

5、
　　0.091±0.023）呈增加趨勢(shì)，輕度哮喘組和中度哮喘組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、重度哮喘組間比較差異差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），輕、中度哮喘組與健康志愿者（0.124±0.021）比較均減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），重度哮喘組與健康志愿者組（1.52±0.37）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）如表3，圖4；
　　3）KLF2核/漿平均光密度值：免疫熒光檢測(cè)KLF2在中性

6、粒細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位，采用Image-Pro Plus6.0檢測(cè)核/漿平均光密度值發(fā)現(xiàn)輕、中、重度哮喘組 KLF2核/漿平均光密度值（0.33±0.10、0.58±0.14、0.72±0.15）呈逐漸增加的趨勢(shì)，輕度哮喘組和中度哮喘組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中、重度哮喘組間比較差異差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕、中、重度哮喘與健康志愿者組（0.14±0.04）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），如表3，圖5

7、；
　　4）中性粒細(xì)胞凋亡率與KLF2蛋白表達(dá)做Pearson相關(guān)性分析（r=0.1208， P>0.05），提示無(wú)相關(guān)性；
　　5）中性粒細(xì)胞凋亡率與中性粒細(xì)胞內(nèi)KLF2核/漿平均吸光度值做Pearson相關(guān)性分析（r=-0.7754，P＜0.001），提示兩者之間呈負(fù)相關(guān)。
　　4.哮喘患者RelAmRNA和蛋白表達(dá)變化及與凋亡的關(guān)系
　　1）RelAmRNA相對(duì)表達(dá)：正常對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組RelAm

8、RNA相對(duì)表達(dá)量（0.08±0.07、1.11±0.44、2.33±0.56、2.65±0.44）呈上升趨勢(shì)，正常對(duì)照組、輕、中度哮喘組間兩兩比較，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），健康對(duì)照組、輕度哮喘組與重度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,中度哮喘組與重度哮喘組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　2）RelA蛋白相對(duì)表達(dá)：對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組RelA蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.039±0.024、

9、0.092±0.046、0.187±0.045、0.201±0.058）呈上升趨勢(shì)，正常對(duì)照組、輕、中度哮喘組間兩兩比較，差異均有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），對(duì)照組、輕度哮喘組與重度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,中度哮喘組與重度哮喘組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　3）RelA核/漿平均光密度值：正常對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組RelA核/漿平均光密度值（0.09±0.04、0.28±0.13

10、、0.63±0.26、0.74±0.24）呈上升趨勢(shì)，正常對(duì)照組、輕、中度哮喘組間兩兩比較，差異均有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），正常對(duì)照組、輕度哮喘組與重度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中度哮喘組與重度哮喘組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　4）中性粒細(xì)胞凋亡率與RelA蛋白表達(dá)做Pearson相關(guān)性分析（r=-0.8079， P＜0.001），提示兩者間呈負(fù)關(guān)性；
　　5）中性粒細(xì)胞凋

11、亡率與中性粒細(xì)胞內(nèi)RelA核/漿平均吸光度值做Pearson相關(guān)性分析（r=-0.7332，P＜0.001），提示兩者之間呈負(fù)相關(guān)；
　　5.哮喘患者KLF2/RelA比例變化及與凋亡的關(guān)系
　　1）KLF2/RelA蛋白比值：輕、中、重度哮喘組（9.8±4.4、2.7±1.3、7.8±2.9）較正常對(duì)照組（42.1±16.2）降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01，輕、中、重度哮喘組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05

12、）；
　　2）KLF2/RelA蛋白比值與中性粒細(xì)胞凋亡凋亡做Pearson相關(guān)性分析（r=0.6689，P＜0.001），提示兩者之間呈正相關(guān)；
　　6.哮喘患者Bcl-xl的表達(dá)變化
　　正常對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.870±0.252、0.481±0.257、0.047±0.031、0.019±0.015）呈降低趨勢(shì)，正常對(duì)照組、輕、中度哮喘組間兩兩比較，差異均有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P