HPV16之E2蛋白CTL表位的設(shè)計(jì)及其功能研究.pdf

1、宮頸癌是最常見(jiàn)的女性腫瘤之一，其發(fā)生與人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)，尤其是HPV16，18感染密切相關(guān)。目前基于HPV16的治療性疫苗針對(duì)的靶蛋白主要為早期蛋白E6或E7，這些疫苗有一定的療效。但最近的研究也發(fā)現(xiàn)：機(jī)體對(duì)高危型HPV病毒(HPV16、HPV18)E6、E7蛋白的免疫反應(yīng)與病變的自行消退沒(méi)有必然聯(lián)系，這或許是因?yàn)镋6、E7的高表達(dá)是在晚期病變組織中，而在感染初期和宮頸上皮瘤發(fā)生的早期，它們

2、的表達(dá)被E2蛋白抑制了。相反，E2蛋白作為病毒DNA復(fù)制和基因表達(dá)的主要調(diào)控蛋白，在感染初期和宮頸上皮瘤早期呈穩(wěn)定穩(wěn)定，且豐度較高。由此可以設(shè)想：若以HPV16E2蛋白為靶點(diǎn)，或許能夠在HPV16所致疾病的早期及時(shí)阻斷病變的進(jìn)一步發(fā)展?；谝陨霞僭O(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究課題。 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)在機(jī)體抗腫瘤和抗病毒的免疫過(guò)程中擔(dān)負(fù)重要角色，在抗原刺激和相應(yīng)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，能夠迅速增殖

3、、分化，執(zhí)行特異性殺傷功能，是設(shè)計(jì)治療性疫苗的理論基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)HPV16E2相關(guān)疫苗，誘導(dǎo)針對(duì)該蛋白的特異性CTL活化，阻斷HPV16所致病變，將成為新的治療方法。 完整的HPV16E2蛋白除包含CTL表位外，還包含了B細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位等多種表位，若以完整蛋白做為治療性疫苗，一方面使表位的針對(duì)性不強(qiáng)，另一方面，“免疫偏離”(immunedeviation)、“免疫反轉(zhuǎn)”(immunesubvertion)等現(xiàn)象均提示：這些表

4、位間可能相互抑制，導(dǎo)致抗原性消減。所以，僅以E2蛋白CTL表位為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)制備的治療性疫苗效果可能會(huì)更好。 基于此思想，本文從HPV16E2蛋白的CTL表位設(shè)計(jì)出發(fā)，體外誘導(dǎo)特異性CTL，同時(shí)構(gòu)建表達(dá)E2蛋白的靶細(xì)胞模型，最后評(píng)估該特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 本研究主要由三部分組成： 第一部分HPV16之E2蛋白CTL表位的分析、多肽合成與鑒定 基于量化基序法確定E2蛋白的CTL表位，選取結(jié)合系數(shù)最

5、高的2條九肽和1條十肽作為候選表位。三條多肽由上海吉爾生化有限公司采用Fmoc固相合成法合成，多肽合成的收集峰圖和分子量質(zhì)譜分析均提示多肽純度高、質(zhì)量好。 第二部分質(zhì)粒pIRES2-HPV16E2-EGFP的構(gòu)建、鑒定及其在Caski細(xì)胞中的表達(dá) 即表達(dá)E2蛋白的靶細(xì)胞模型的構(gòu)建：以含有人HPV16全基因組的質(zhì)粒pBR322/HPV16為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切后插入pIRES2-EGFP

6、真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，酶切鑒定和DNA序列測(cè)定證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。收獲處于指數(shù)生長(zhǎng)期Caski細(xì)胞，使用GeneJammer轉(zhuǎn)染試將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞內(nèi)，使用G418篩選14天后，熒光顯微鏡下見(jiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞約占50％。 第三部分表位特異性CTL的構(gòu)建與其殺傷效應(yīng)的研究 經(jīng)基因分型鑒定，取HLA-A*0201陽(yáng)性志愿者外周血，使用Ficoll分層液分離，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloo