HPV16 E6蛋白與hDaxx在HeLa細(xì)胞共定位及對(duì)凋亡的影響.pdf

1、目的：分析人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E6蛋白與hDaxx在HeLa細(xì)胞中的分布與定位，探討兩蛋白高表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究E6蛋白在HPV16致癌機(jī)制中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1)采用脂質(zhì)體法分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6或pEGFP-C1/hDaxx，Western blot檢測(cè)DsRed-HPV16 E6和EGFP-hDax

2、x融合蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。
　　(2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6與pEGFP-C1/hDaxx，激光共聚焦顯微鏡觀察HPV16 E6蛋白與hDaxx在HeLa細(xì)胞中的分布，并分析共定位。
　　(3) HPV16 E6與hDaxx真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。
　　(4)用Hoechst33258染色細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)

3、，并對(duì)活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。分別將0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx和2.0μg pcDNA3.1(-)/HPV16 E6瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以空細(xì)胞組、pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1(-)/hDaxx轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，TNF-α處理12h后分別收集各組細(xì)胞，經(jīng)70％的乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。
　　(5)按(4)法轉(zhuǎn)染HeLa

4、細(xì)胞，TNF-α處理細(xì)胞12h后，檢測(cè)caspase-8與caspase-3的相對(duì)活性。
　　結(jié)果：
　　(1) Western-blot結(jié)果顯示HPV16 E6和hDaxx重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)了免疫反應(yīng)帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和HeLa細(xì)胞組未見免疫反應(yīng)帶。
　　(2)在激光共聚焦顯微鏡下，DsRed-HPV16 E6融合蛋白所發(fā)的紅色熒光主要分布于胞核，EGFP-hDaxx融合蛋白所發(fā)的綠色熒光僅分布于胞核；HPV16

5、E6和hDaxx共轉(zhuǎn)染組，綠色熒光和紅色熒光在胞漿較弱呈均勻分布，在胞核較強(qiáng)且集中分布在核膜附近，紅色熒光同綠色熒光融合成黃色熒光。
　　(3)與HPV16 E6轉(zhuǎn)染組比較，HPV16 E6與hDaxx共轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞增殖活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　(4) TNF-α處理的各組細(xì)胞均可見胞核呈現(xiàn)深染、致密的顆粒塊狀熒光的凋亡細(xì)胞。pcDNA3.1(-)/E6轉(zhuǎn)染組凋亡率低于pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組，差

6、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 E6轉(zhuǎn)染組相比，共轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著升高（P<0.01），且凋亡率隨pcDNA3.1(-)/hDaxx轉(zhuǎn)染量的增加而升高。
　　(5)與空載體組相比，E6轉(zhuǎn)染組 caspase-8和caspase-3兩種酶活性均顯著降低（P<0.01）；與 E6轉(zhuǎn)染組相比，共轉(zhuǎn)染組 caspase-8和caspase-3相對(duì)活性隨pcDNA3.1(-)/hDaxx轉(zhuǎn)染量增加而升高；當(dāng)hDaxx為2.0μg時(shí)，差異

7、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　(1) DsRed-HPV16 E6與EGFP-hDaxx融合蛋白能在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，HPV16 E6使部分hDaxx從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，且兩者發(fā)生共定位。
　　(2) HPV16 E6蛋白抑制TNF-α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡；在表達(dá)HPV16 E6蛋白的HeLa細(xì)胞，hDaxx高表達(dá)通過劑量依賴方式促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)凋亡。
　　(3) HPV16 E6蛋白可