HPV16 E6蛋白與hDaxx的相互作用及其對凋亡的影響.pdf

1、目的:應用酵母雙雜交法檢測人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E6蛋白與hDaxx的相互作用，并初步探討其相互作用對凋亡的影響，為進一步研究E6蛋白在HPV16致癌機制中的作用提供一定的實驗依據(jù)。 方法: ⑴ pGADT7/E6重組體的構建：采用Primer Premier5.0軟件設計特異性引物，并引入EcoRI和BamHI酶切位點，PCR擴增HPV16 E6基因。用EcoRI和BamHI分別雙酶切PCR產(chǎn)物和質粒pGAD

2、T7，純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。對重組質粒進行酶切鑒定及序列分析。 ⑵ pGBKT7/hDaxx重組體的構建：用EcoRI和SalI分別雙酶切pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7，分別純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選到陽性克隆后，對重組質粒行酶切鑒定。 ⑶酵母雙雜交檢測E6蛋白與hDaxx的相互作用：分4組共轉化酵母菌AH109，A組為 p

3、GADT7和pGBKT7，B組為pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx，C組為pGADT7/T和pGBKT7/Lam，D組為pGADT7/T和pGBKT7/p53。將轉化菌分別接種于SD/-Trp-Leu（二缺陷）固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～4d，待平板上長出單個菌落后，再將該菌落接種于SD/-Trp-Leu-His（三缺陷）和SD/-Trp-Leu-His-Ade（四缺陷）平板，30℃培養(yǎng)2～4d，觀察酵母菌的生長情況。裂解B組四

4、缺陷平板上的酵母菌，提取蛋白質，經(jīng)Western blot檢測E6蛋白和hDaxx在酵母菌中的表達。 ⑷流式細胞術檢測凋亡：分別將0μg、10μg、20μg、30μg的pcDNA3.1(-)/hDaxx和10μg pcDAN3.1(-)/E6瞬時共轉染Hela細胞，以pcDNA3.1(-)轉染組和空細胞組作為對照。5-FU處理36h后分別收集各組細胞，經(jīng)75％的乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。用統(tǒng)

5、計軟件SPSS13.0分析實驗數(shù)據(jù)。 結果: ⑴ pGADT7/E6重組體的構建：重組質粒經(jīng)雙酶切及測序分析，所克隆的目的片段與GenBank上公布的HPV16 E6基因(Pubmed NC_001526)序列一致。 ⑵ pGBKT7/hDaxx重組體的構建：重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到了與預期大小一致的約2.2kb的條帶。 ⑶ E6蛋白和hDaxx相互作用的檢測：4個組的二缺陷平板上均可長出白色菌落，但接

6、種到三缺陷和四缺陷平板后，只有B組、D組轉化菌可以生長，A組、C組未見菌落生長。提取B組四缺陷平板上的酵母蛋白，經(jīng)Western blot檢測到E6蛋白和hDaxx的表達。 ⑷凋亡率的檢測：各組Hela細胞經(jīng)5-FU處理后，流式細胞術測得，pcDAN3.1(-)/E6 轉染組細胞凋亡率明顯低于pcDNA3.1(-)轉染組和空細胞組，結果差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。共轉染pcDNA3.1(-)/E6和pcDNA3.1(-)

7、/hDaxx的Hela細胞，隨pcDNA3.1(-)/hDaxx轉染量的增加，凋亡率有所上升。 結論: ⑴成功地構建了pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx酵母菌真核表達載體，并可在酵母菌AH109中表達。 ⑵ HPV16 E6與hDaxx在酵母細胞內發(fā)生相互作用。 ⑶ HPV16 E6蛋白可抑制5-FU誘導的Hela細胞凋亡；在表達E6蛋白的Hela細胞中，hDaxx的過高表達促進5-FU誘導的凋