組蛋白去乙?；竻⑴c斑馬魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)的早期發(fā)育以及內(nèi)耳前體細(xì)胞的分化過(guò)程.pdf

1、內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷丟失所導(dǎo)致的耳聾是感音神經(jīng)性聾的主要原因。哺乳類(lèi)動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞受損后不具備自我修復(fù)和再生能力，故由毛細(xì)胞變性壞死所引發(fā)的耳聾是不可治愈的。但在某些魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)動(dòng)物中的毛細(xì)胞損傷丟失后可以繼續(xù)增殖，從而自發(fā)生成新的毛細(xì)胞，可用于毛細(xì)胞再生的研究。斑馬魚(yú)因與人類(lèi)有很高的同源性，發(fā)育周期短等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。因胚胎身體透明，方便構(gòu)建各種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，用于活細(xì)胞成像觀察(live imaging)這些基因的表達(dá)模式。斑馬魚(yú)

2、側(cè)線(xiàn)器毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳類(lèi)動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞類(lèi)似，且因側(cè)線(xiàn)器位于體表，使得毛細(xì)胞易于被觀察檢測(cè)。上述優(yōu)勢(shì)使得斑馬魚(yú)成為研究毛細(xì)胞發(fā)育及再生的較為理想的模式生物。
　　側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)(lateral line system，LL)作為魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)特有的感覺(jué)器官，具有感知水流、水壓和聽(tīng)覺(jué)等功能。它由多個(gè)位于體表的神經(jīng)丘(neuromast)細(xì)胞為單位組成。側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)根據(jù)分布排列的位置分為前部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)(Anterior laterallin

3、e system，ALL)和后部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)(Posterior lateral line system，PLL)，前者包括頭部的神經(jīng)丘細(xì)胞，后者包括軀干和尾部的神經(jīng)丘細(xì)胞。側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)單位是由位于神經(jīng)丘中央的毛細(xì)胞(Hair Cell,HC)以及位于周邊的支持細(xì)胞(Supporting Cell，SC)所構(gòu)成。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能及器官發(fā)育等方面均展開(kāi)了廣泛系統(tǒng)的研究。
　　組蛋白的乙?；?去乙?；揎検?/p>

4、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制之一，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞周期等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。組蛋白的乙?；饕c基因轉(zhuǎn)錄的激活相關(guān)，組蛋白的去乙酰化則主要與基因沉默有關(guān)。組蛋白的乙酰化修飾是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)與組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(histone deacetylases，HDACs)的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)維持的。組蛋白乙?；?去乙?；揎椩谂咛グl(fā)育、多種器官和系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生

5、等生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用。近年的研究表明組蛋白去乙?；揎椗c神經(jīng)干細(xì)胞的分化關(guān)系密切，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶影響神經(jīng)前體細(xì)胞的分化方向。但關(guān)于乙酰化/去乙?；揎椩诼?tīng)覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育等一系列生理學(xué)以及病理學(xué)過(guò)程中的作用的研究并不多見(jiàn)。
　　有研究表明組蛋白去乙?；揎椗c內(nèi)耳感覺(jué)上皮支持細(xì)胞的分裂增殖有密切關(guān)系。組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)雞橢圓囊感覺(jué)上皮支持細(xì)胞的再生性增殖有抑制作用。然而組蛋白去乙酰化修飾在斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)器早期發(fā)育以

6、及神經(jīng)丘毛細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。我們首先以斑馬魚(yú)為模型觀察組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育的影響。重點(diǎn)研究HDACs在斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)原基的遷徙，神經(jīng)丘的沉積以及側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化這三個(gè)過(guò)程中的作用，為今后研究魚(yú)類(lèi)后部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制提供了一種新的結(jié)合點(diǎn)。最后我們觀察HDACs對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)耳前體細(xì)胞定向分化的影響，將組蛋白修飾與內(nèi)耳前體細(xì)胞定向分化聯(lián)系起來(lái)，為治療感音神經(jīng)性聾提供了一種新的思路。<

7、br>　　第一部分組蛋白去乙酰化酶參與斑馬魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)原基遷徙以及神經(jīng)丘沉積過(guò)程
　　目的:
　　研究組蛋白去乙?；笇?duì)斑馬魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)原基(posterior lateral lineprimordium)遷徙以及神經(jīng)丘沉積的影響。
　　材料與方法:
　　選擇6hpf的斑馬魚(yú)胚胎，分別用不同濃度的組蛋白去乙?；敢种苿┍焖猁}(VPA)、曲古菌素A(TSA)處理胚胎，用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察斑

8、馬魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)原基的遷徙以及神經(jīng)丘的沉積情況。合成地高辛標(biāo)記的cxcr7b反義RNA探針，進(jìn)行斑馬魚(yú)全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交，研究cxcr7b mRNA在原基遷移過(guò)程中的表達(dá)情況。BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，觀察原基細(xì)胞團(tuán)的增殖情況。使用蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測(cè)斑馬魚(yú)整體胚胎組蛋白H3和H4的乙?；健?br>　　結(jié)果:
　　1.VPA的處理對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的形態(tài)、存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響。表現(xiàn)為隨著藥

9、物濃度增加，身體畸形率增高、胚胎的孵出率和存活率均下降，高濃度VPA(200μM)處理6hpf胚胎持續(xù)至3dpf時(shí)，死亡率高達(dá)20％，藥物持續(xù)處理至5dpf時(shí)，胚胎基本全部死亡。VPA處理組亦有明顯的行為學(xué)改變，表現(xiàn)為以頭部為軸的風(fēng)車(chē)式轉(zhuǎn)動(dòng)以及異常的逃脫反應(yīng)。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)表明VPA處理組的AceH3和AceH4蛋白水平增高;
　　2.VPA和TSA處理6hpf斑馬魚(yú)胚胎，發(fā)現(xiàn)藥物干擾后部側(cè)線(xiàn)系統(tǒng)(PLL)的早期發(fā)育，表現(xiàn)為延緩原

10、基遷徙速度，且呈濃度依賴(lài)性。cxcr7b的原位雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該作用;
　　3.VPA和TSA處理組的側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘的空間分布異常，表現(xiàn)為處理組較對(duì)照組神經(jīng)丘所沉積的肌節(jié)位置滯后，尤其是軀干部第一個(gè)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘(L1)的沉積位置顯著延后，且與藥物濃度呈正相關(guān);
　　4.免疫熒光染色分析原基細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示VPA和TSA處理組的原基細(xì)胞團(tuán)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.VPA的處理

11、對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的形態(tài)，存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響;
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚硌泳彴唏R魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)原基的遷徙速度;
　　3.組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚碛绊懓唏R魚(yú)后部側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘的沉積過(guò)程，改變其空間分布;
　　4.組蛋白去乙酰化酶抑制劑的處理對(duì)原基細(xì)胞團(tuán)有增殖抑制作用。
　　第二部分組蛋白去乙?；竻⑴c斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘毛細(xì)胞的早期發(fā)育
　　目的:
　　研究組蛋白去乙?；笇?duì)斑馬魚(yú)后部

12、側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化以及神經(jīng)丘細(xì)胞增殖的影響。
　　材料與方法:
　　選擇3dpf的AB品系以及Brm-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎，分別用不同濃度的VPA(50、100、150μM),TSA(0.05、0.1、0.2μM)以及MS-275(5、10、15μM)處理胚胎發(fā)育至5dpf或7dpf。以MyosinⅥ以及GFP標(biāo)記和辨別已分化的毛細(xì)胞，活細(xì)胞染料FM1-43FX標(biāo)記有功能的毛細(xì)胞，BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，TUNEL和cl

13、eaved caspase-3染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞，在熒光顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物處理對(duì)神經(jīng)丘細(xì)胞的增殖、凋亡及毛細(xì)胞分化情況的影響。使用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測(cè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)胚胎組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙?；降挠绊?。
　　結(jié)果:
　　1.組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的處理致使神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)目減少，并呈劑量依賴(lài)性關(guān)系。同時(shí)使用

14、活細(xì)胞染料FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞，結(jié)果表明抑制劑的處理亦導(dǎo)致有功能的毛細(xì)胞數(shù)目減少。免疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)的結(jié)果均顯示抑制劑處理組的組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙?；缴摺?br>　　2.BrdU標(biāo)計(jì)增殖細(xì)胞，結(jié)果顯示組蛋白去乙?；敢种苿┨幚斫M神經(jīng)丘細(xì)胞團(tuán)中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。TSA（0.1μM）處理組神經(jīng)丘中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為8.2±0.3(n=35)，對(duì)照組

15、BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P＜0.05)。VPA(100μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為8.1±0.3(n=35)，對(duì)照組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為11.8±0.4(n=46)(P＜0.05)。MS-275(10μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為6.8±0.3(n=32)，對(duì)照組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P＜0.05)。
　　3.高濃度或長(zhǎng)時(shí)間的TSA處理可誘導(dǎo)神經(jīng)丘細(xì)胞凋亡

16、。神經(jīng)丘細(xì)胞可見(jiàn)TUNEL，cleaved caspase-3陽(yáng)性染色。
　　結(jié)論:
　　1.組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘毛細(xì)胞的分化起抑制作用;
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿?duì)斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘細(xì)胞有增殖抑制作用;
　　3.組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)神經(jīng)丘細(xì)胞凋亡呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。
　　第三部分組蛋白去乙?；竻⑴c新生小鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞的分化
　　目的:
　　研究組蛋白去乙酰化酶在

17、新生小鼠耳蝸高增殖前體細(xì)胞向感覺(jué)上皮尤其是毛細(xì)胞方向分化過(guò)程中的作用。
　　材料與方法:
　　從新生(P0)ICR小鼠聽(tīng)泡內(nèi)取得耳蝸基底膜組織，經(jīng)酶解消化后，用10％胎牛血清培養(yǎng)液中止消化。離心收集單細(xì)胞懸液，無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。至第8天時(shí)收集懸浮細(xì)胞球進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組給予TSA(0.1μM)處理，對(duì)照組給予DMSO處理，誘導(dǎo)分化1周后去除處理因素，繼續(xù)使用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1周。收集第8天的懸浮細(xì)胞球和

18、貼壁培養(yǎng)14天的分化細(xì)胞，運(yùn)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、Pax2，myosinⅦA和Sox2的表達(dá);運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　內(nèi)耳前體細(xì)胞向毛細(xì)胞方向分化時(shí)，給予TSA處理，結(jié)果觀察到TSA處理組的myosinⅦA與Sox2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均明顯減少。同時(shí)檢測(cè)前體細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示TSA處理組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，且B