組蛋白去乙酰化酶抑制劑Oxamflatin對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育率的影響.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)是指將一個(gè)分化的體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成一個(gè)重構(gòu)胚胎，并發(fā)育產(chǎn)生與供體細(xì)胞遺傳背景一致的克隆后代的技術(shù)。自1996年多利羊誕生以來(lái)，研究人員利用體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)成功克隆出很多哺乳動(dòng)物后代，如小鼠、狗、貓、牛、豬等。但盡管該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了近20年，但體細(xì)胞克隆效率還是很低（哺乳動(dòng)物大約1％-5％），而且體細(xì)胞克隆后代常常出現(xiàn)一些異常的表型:表現(xiàn)為胚胎著床率低、胎兒流產(chǎn)率高，克隆動(dòng)物體型過(guò)大并伴隨各種器

2、官發(fā)育缺陷的癥狀，也被稱為大型胎兒綜合癥。但表型異常的克隆動(dòng)物可以正常繁殖且后代表型都正常，說(shuō)明克隆動(dòng)物的異常表型是由異常的表觀遺傳修飾造成的而不是由于遺傳物質(zhì)的改變引起的。目前研究普遍認(rèn)為體細(xì)胞核移植效率低的原因是卵母細(xì)胞對(duì)體細(xì)胞核不完全或異常的重編程導(dǎo)致的。
　　體細(xì)胞核移植技術(shù)是一項(xiàng)很有應(yīng)用前景的技術(shù)，不僅可以幫助我們了解體細(xì)胞重編程的機(jī)理，同時(shí)可以用于人的器官移植等醫(yī)學(xué)研究。SCNT技術(shù)與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因

3、豬，如抗病型豬，優(yōu)良肉品質(zhì)性狀豬，環(huán)境友好型豬等。鑒于體細(xì)胞核移植重要的應(yīng)用價(jià)值以及其較低的克隆效率，本研究圍繞如何能提高豬的克隆效率這一基本問(wèn)題展開(kāi)，在提高其體外克隆效率的同時(shí)，在重編程的分子機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，其主要結(jié)果如下所述:
　　1.通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，在豬合子培養(yǎng)基（PZM-3）中添用一定劑量的組蛋白去乙?；敢种苿㎡xamflatin，能顯著提高豬體外克隆胚胎囊胚形成率。然后我們優(yōu)化了Oxamflatin的處理?xiàng)l

4、件（不同的處理濃度和持續(xù)時(shí)間），發(fā)現(xiàn)用1μM的組蛋白去乙?；敢种苿㎡xamflatin處理激活后的重構(gòu)胚胎15h，顯著提高了其體外囊胚發(fā)育率（未處理組vs.處理組;10.3％ vs.25.5％;p＜0.05）。
　　2.用1μM的Oxamflatin處理豬克隆胚胎15h顯著降低了重構(gòu)胚胎原核時(shí)期總的去乙?；傅幕钚?，提高了克隆胚胎原核期，2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期，總的組蛋白H3K9和H4K5的乙?；?。我們檢測(cè)了四種類(lèi)型的豬的組蛋白

5、去乙酰化酶（包括HDAC1-11，和Sirt1，2）在MⅡ期卵母細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDAC1、2和3在MⅡ期卵母細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量比胎兒成纖維細(xì)胞高，同時(shí)也相對(duì)比其他類(lèi)型的組蛋白去乙酰化酶表達(dá)要高。Oxamflatin處理顯著降低了重構(gòu)胚胎原核時(shí)期HDAC1的表達(dá)，部分上解釋了Oxamflatin處理介導(dǎo)的高乙酰化的組蛋白H3K9和H4K5水平。
　　3.我們同時(shí)檢測(cè)了一個(gè)非組蛋白α-tubuli

6、n蛋白的乙酰化水平，發(fā)現(xiàn)用1μM的Oxamflatin處理15h顯著提高了豬重構(gòu)胚胎的中間體和紡錘體在胚胎激活后的前兩個(gè)有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程中乙?；?tubulin的水平，這可能是通過(guò)抑制HDAC6的表達(dá)所介導(dǎo)的。
　　4.通過(guò)熒光定量PCR我們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)在豬MⅡ期卵母細(xì)胞中占主導(dǎo)，它的表達(dá)量相對(duì)于其同源基因DNMT2，DNMT3a和3b的表達(dá)量要高出50多倍。通過(guò)免疫熒光染色我們檢測(cè)了豬克隆胚胎在2

7、細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期總的5-mC和5-hmC水平，結(jié)果表明，豬SCNT胚胎從2細(xì)胞到4細(xì)胞時(shí)期，總的5-mC和5-hmC水平逐漸降低。用1μM的Oxamflatin處理豬重構(gòu)胚胎15h顯著地降低了豬克隆胚胎2細(xì)胞時(shí)期總的DNA甲基化水平，同時(shí)降低了DNMT1在2細(xì)胞時(shí)期的表達(dá)。
　　5.用1μM的Oxamflatin處理豬重構(gòu)胚胎15h顯著提高了多潛能基因POU5F1在豬克隆胚胎囊胚階段的表達(dá)，這可能是通過(guò)降低POU5F1啟動(dòng)子區(qū)域D

8、NA甲基化水平引起的。但是，Oxamflatin處理并沒(méi)有改變豬衛(wèi)星DNA序列的甲基化水平。
　　6.低劑量的Oxamflatin處理沒(méi)有抑制豬胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，Oxamflatin處理同樣導(dǎo)致了豬胎兒成纖維細(xì)胞較高的組蛋白H3K9、H4K5和非組蛋白α-tubulin的乙酰化水平，同時(shí)Oxamflatin處理在一定程度上降低了豬胎兒成纖維細(xì)胞總的DNA甲基化水平。但是用Oxamflatin預(yù)處理的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核供