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1、目的:自第一只克隆羊誕生以后,牛,羊,貓,鼠,驢,馬,狗等動(dòng)物也都被相繼克隆出來,然而體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的克隆動(dòng)物其成功率低,這與表觀遺傳異常有一定關(guān)聯(lián),這其中就包括組蛋白乙酰化的異常。通過組蛋白去乙?;种苿?,可以改變表觀遺傳狀態(tài),從而進(jìn)一步提高體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育潛能。LBH589,CUDC-101,PXD101,已經(jīng)有研究證明這三種去乙?;种苿┛梢蕴岣呓M蛋白乙酰化水平,但是在體細(xì)胞克隆胚胎方面至今還未有人使用。本研究是首次使用
2、這三種去乙?;种苿┨骄科鋵?duì)豬SCNT胚胎的影響。
方法:利用不同濃度的組蛋白去乙?;种苿?LBH589,CUDC-101 and PXD101)處理豬體細(xì)胞克隆胚胎24小時(shí),尋找最適合濃度,隨后用最適濃度處理不同時(shí)間。確定好最佳時(shí)間和最佳濃度后,進(jìn)行免疫熒光染色觀察胚胎乙酰化水平。在每種藥品處理之后,將胚胎通過胚胎移植移入代孕母豬體內(nèi),觀察其妊娠情況。
結(jié)果:(1)在體外發(fā)育的胚胎給予不同濃度的LBH589處理,
3、觀察各濃度對(duì)于胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)50nM的LBH589處理24h的胚胎與對(duì)照組以及5,500nM處理組相比,其囊胚率明顯提高(32.4% vs.11.8%,12.1%,and10.0%,respectively,P<0.05)。用50nM的LBH589處理重構(gòu)胚不同的時(shí)間,并在處理后使用6-DMAP激活胚胎。結(jié)果可知,經(jīng)24h處理的胚胎,囊胚率高于其他組別。對(duì)用LBH589處理6h的胚胎使用H4K12抗體進(jìn)行免疫熒光染色。
4、結(jié)果顯示,經(jīng)LBH589處理后的胚胎,其熒光強(qiáng)度強(qiáng)于其他組別。對(duì)LBH589處理的胚胎以及未經(jīng)處理胚胎進(jìn)行胚胎移植,移植到代孕母豬體內(nèi)。結(jié)果顯示,經(jīng)藥物處理以及未經(jīng)藥物處理的胚胎移植成功率分別為100%和66.7%。綜上所述,LBH589可以通過改變表觀遺傳狀態(tài)來提高SCNT胚胎的發(fā)育潛力以及重編程的能力,并能增加囊胚的質(zhì)量。(2)發(fā)現(xiàn)對(duì)豬SCNT胚胎使用1μM的CUDU-101處理24h,可以明顯提高胚胎的發(fā)育能力(18.5%vs.1
5、0.3%,P<0.05)。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)其體內(nèi)發(fā)育力,將使用 CUDU-101處理的胚胎進(jìn)行胚胎移植到兩頭代孕母豬體內(nèi),結(jié)果顯示一頭母豬妊娠且懷有6個(gè)胎兒。對(duì)經(jīng)藥物處理以及未經(jīng)藥物處理的胚胎分別進(jìn)行了H3K9組蛋白乙?;降难芯?。結(jié)果顯示,在1細(xì)胞期,未經(jīng)CUDU-101處理的胚胎其乙酰化水平明顯低于經(jīng)CUDU-101處理的胚胎。綜上所述,CUDU-101可以顯著提高豬SCNT胚胎體內(nèi)及體外核重編程的發(fā)育能力。(3)經(jīng)0.5μM的PX
6、D101處理的胚胎其囊胚率較對(duì)照組相比有明顯提高(23.3%vs.11.5%,P<0.05)。隨后,使用0.5μM的PXD101分別對(duì)胚胎處理不同的時(shí)間。結(jié)果顯示,處理24h的組別其囊胚率明顯高于對(duì)照組(25.7%vs.10.6%,P<0.05)。將使用PXD101處理的胚胎進(jìn)行胚胎移植到兩頭代孕母豬體內(nèi),結(jié)果顯示一頭妊娠且懷有4個(gè)胎兒。在探究PXD101對(duì)胚胎乙?;接绊懙膶?shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)PXD101處理的組別,在1細(xì)胞期和
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