C3d單抗的研制及其在滴金免疫測定C3d方面的初步應(yīng)用.pdf

1、目的:研制C3d單抗并標(biāo)記膠體金,利用免疫金層析測試法(immunochromatographic assay)快速、簡便測定輕型、中重型乙型病毒性肝炎患者血漿C3d水平,以判斷其體內(nèi)補(bǔ)體活化情況.方法:1.C3d單克隆抗體的制備用菊糖活化并結(jié)合人新鮮血清中的補(bǔ)體C3b成分,制備菊糖-C3b,以此作為抗原去免疫BALB/c小鼠,制備雜交瘤.以羊抗C3IgG包被酶標(biāo)反應(yīng)板,并從人老化血清中捕獲C3d,以此檢測BALB/c小鼠血清C3d抗體

2、,并篩選陽性雜交瘤.等BALB/c小鼠血清抗C3d陽性時(shí),將其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合并用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng),通過檢測雜交瘤上清中分泌C3d單抗情況,篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)擴(kuò)增和多次亞克隆,直至所有單個(gè)細(xì)胞形式的克隆培養(yǎng)上清均呈C3d抗體陽性,可確定為單克隆抗體細(xì)胞系建立.將雜交瘤于BALB/c小鼠腹水中擴(kuò)增,檢測C3d單抗并收集和提純.2.C3d單抗的特異性的分析利用protein G柱親和層析提取單抗IgG和C3d復(fù)合

3、體,一并做SDS-PAGE,根據(jù)分子量,判斷與單抗特異結(jié)合的是否為C3d,間接證明C3d單抗的特異性.3.C3d單抗標(biāo)記膠體金將提線的C3d單抗IgG進(jìn)行低鹽透析,確定與膠體金標(biāo)記的最適量,并在pH約8.0下進(jìn)行標(biāo)記.離心濃縮.4.免疫金層析試條的制備利用提純的羊抗人C3 IgG和羊抗鼠IgG分別在硝酸纖維膜上劃線并封閉,與吸樣材料、玻璃纖維膜(免疫金墊料)、吸水材料組合在一起制備免疫金層析試條.根據(jù)所測定的30例正常人和30例輕型、3

4、0例中重型肝炎患者血漿C3d水平確定試條應(yīng)達(dá)到的檢測限,通過在免疫金中加入不同濃度的未標(biāo)記膠體金(游離)的同克隆C3d單抗來調(diào)整檢測限.用這些檢測限不同的試條分別去測定樣品中的C3d.結(jié)論:1.在沒有C3d純品的情況下,利用菊糖-C3b作為抗原,酶標(biāo)反應(yīng)板包被C3 IgG多抗再捕獲C3d作C3d單抗檢測板,從而制備C3d單抗的方法是切實(shí)可行的.2.用proteinG親和柱提取單抗及其抗原,將該復(fù)合物一并做SDS-PAGE,分析單克隆抗體