C3d的免疫負調控作用及其可能的機制.pdf

1、為了證明三拷貝C3d的免疫負調控作用,該課題分別選擇hCGβ、HER-2/neu、HBV-preS2/S作為模式抗原,設計相應的基因疫苗,通過基因免疫手段免疫小鼠以觀察C3d對特異性免疫應答的調節(jié)作用,并探討其可能的機制.第一部分C3d的免疫負調控現(xiàn)象在以前的研究中我們曾發(fā)現(xiàn)C3d抑制hCGβ誘導的體液免疫應答,為確證C3d對hCGβ免疫應答的負調控作用,我們進行了該部分研究.采用酶切法獲得hCGβ鏈的編碼基因(513bp),定向克隆入

2、TR421和TR421-C3d3質粒,獲得hCGβ的真核表達載體TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3重組質粒.為觀察hCGβ基因疫苗在真核細胞內(nèi)的表達,用脂質體法將TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3質粒轉染人肝癌細胞系-7721細胞.放射免疫法檢測細胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn):重組質粒TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3可在真核細胞中表達hCGβ,而TR421-hCGβ-C3d3質粒在真

3、核細胞中表達hCGβ的量明顯低于TR421-hCGβ組.在此研究基礎上我們探討了C3d對hCGβ基因疫苗誘生的特異性體液免疫應答的調節(jié)作用.以100μg TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3免疫雌性BALB/c小鼠,ELISA法檢測血清抗-hCGβ-IgG抗體,結果顯示所有TR421-hCGβ質粒基因免疫小鼠能夠誘導高水平的抗-hCGβ-IgG特異性抗體,而TR421-hCGβ-C3d3質粒免疫小鼠誘導的抗體

4、水平較低,兩組相比有顯著性差異(P<0.001),提示C3d可抑制hCGβ抗體應答.為了排除我們所用的系統(tǒng)對C3d免疫負調控作用的影響,我們又選擇HBV-preS2/S作為模式抗原,分別構建了TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3.通過RT-PCR檢測HBV基因疫苗在真核細胞內(nèi)mRNA的表達水平,結果顯示preS2/S-C3d3融合蛋白的表達比preS2/S的表達低.在此基礎上,我們以TR421、TR421-p

5、reS2/S和TR421-preS2/S-C3d3免疫BALB/c小鼠,ELISA法檢測血清抗-HBs-IgG抗體,結果發(fā)現(xiàn)TR421-preS2/S重組質粒能誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗-HBs-IgG,而TR421-preS2/S-C3d3重組質粒誘導了更高水平的特異性抗-HBs-IgG,兩者相比有顯著性差異(P<0.05),提示C3d可顯著增強基因免疫誘導的HBV特異性體液免疫應答.第二部分C3d免疫負調控作用的再確立鑒于hCGβ是一種癌

6、胚抗原,我們設想是否還存在C3d對其他癌胚抗原的負調控作用,因而我們選擇了另外一種癌胚抗原-HER-2/neu,進行了該部分研究.通過酶切獲得HER-2/neu胞外區(qū)的編碼基因hECD,定向克隆入TR421和TR421-C3d3質粒,獲得hECD的真核表達載體TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3重組質粒.通過免疫組化方法檢測了TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3在體內(nèi)的表達情況,結果顯示TR421-hEC

7、D、TR421-hECD-C3d3在注射肌肉局部有顯色,而TR421注射肌肉局部無顯色,證實TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3可在體內(nèi)有效表達.在此基礎上探討了C3d對HER-2/neu基因疫苗誘生的特異性體液免疫應答的調節(jié)作用.第三部分C3d免疫負調控作用的可能機制在前兩部分的研究中我們相繼證明了三拷貝C3d負調控基因免疫誘導的hCGβ、HER-2/neu特異性免疫應答,但可以增強基因免疫誘導的HBV特異性免疫應答,

8、分析可能的原因:一是抗原性的差異導致了C3d不同的調節(jié)作用;另一方面CD21-CD19在B細胞對補體—抗原復合物的提呈過程中起著重要作用,C3d可能影響了B細胞對癌胚抗原的抗原提呈,從而導致了C3d的負調控;另外,IL-4在CD21增強B細胞活化中也起著重要作用.我們以hCGβ為模式抗原研究了C3d免疫負調控作用的可能機制.為了檢測C3d對B細胞和巨噬細胞對hCGβ抗原提呈的影響,我們分別用hCGβ、hCGβ-C3d3與B細胞、巨噬細胞

9、共孵育,滅活,然后與不同質粒免疫小鼠脾細胞按一定效靶比共孵育,檢測CPM值發(fā)現(xiàn):巨噬細胞對hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,在TR421-hCGβ、TR421-hCGβ-C3d3重組質粒免疫小鼠脾細胞,SI沒有明顯差異(P>0.05),提示C3d不影響巨噬細胞對hCGβ的提呈;至于B淋巴細胞對hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,TR421-hCGβ-C3d3免疫組的SI都顯著低于TR421-hCGβ(P<0.05),提示C3d負調控了