補(bǔ)體C3d分子的桿狀病毒表達(dá)和分子進(jìn)化研究.pdf

1、補(bǔ)體C3d分子(complement component3d)是補(bǔ)體C3活化后的一個裂解片段,能夠與受體CR2結(jié)合,是連接固有免疫與獲得性免疫的一種重要免疫分子。目前對C3d的研究主要停留在分子佐劑階段,將C3d三連體與抗原基因形成融合蛋白從而成千倍的提高機(jī)體特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),但對不同物種C3d分子變異、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系鮮見報道。本研究通過克隆了16種不同禽類C3d基因,表達(dá)獲得了雞C3d重組蛋白并分析了C3d分子進(jìn)化與結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)系

2、,以豐富C3d的理論與應(yīng)用研究。
　　首先,克隆了16種不同禽類的C3d基因,登錄Genbank并將之與哺乳動物C3d基因序列比較,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建基于C3d編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示哺乳動物與禽類分別居進(jìn)化樹兩端,相距較遠(yuǎn),與傳統(tǒng)物種關(guān)系差異吻合;在禽類區(qū)塊內(nèi)部分化為兩個部分,但與禽類所屬目、科無關(guān)。對C3d分子進(jìn)化過程的選擇情況進(jìn)行分析,表明其整個基因處于純化選擇,但有8個可能發(fā)生陽性選擇的氨基酸位點(diǎn)。以已發(fā)

3、表的人C3d三級結(jié)構(gòu)為模板,同源模建獲得16種禽類C3d的三級結(jié)構(gòu),以雞C3d結(jié)構(gòu)為模板,標(biāo)記陽性選擇位點(diǎn)位置,顯示其均處于暴露區(qū),可能對于支持抗原結(jié)合域、提供CR2結(jié)合所需能量等有重要作用。
　　其次,成功構(gòu)建雞C3d的bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),獲得pFB-C3d-BAC重組病毒,在sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)檢測到高效表達(dá)的C3d蛋白;應(yīng)用Anti-his單抗和Anti-C3d多抗進(jìn)行Western-blot和免疫熒光檢測,表

4、明重組蛋白大小約為35kD,主要為細(xì)胞內(nèi)表達(dá),具有良好的免疫原性,為其免疫機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　最后,采用基于寡核苷酸探針的基因芯片方法檢測了16種禽類對于禽白血病病毒(ALV)B、E、J三種亞型的感染情況,結(jié)果表明7種禽類感染了E亞型,2種禽類感染了J亞型,無明顯B亞型感染信號,結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化和陽性選擇分析,發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化樹上相距較近的禽類染病且為同種亞型的概率較高,與臨近未染病禽類進(jìn)行氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)一些變異發(fā)生在陽性選擇位