補體C3d分子的桿狀病毒表達和分子進化研究.pdf

1、補體C3d分子(complement component3d)是補體C3活化后的一個裂解片段,能夠與受體CR2結合,是連接固有免疫與獲得性免疫的一種重要免疫分子。目前對C3d的研究主要停留在分子佐劑階段,將C3d三連體與抗原基因形成融合蛋白從而成千倍的提高機體特異性免疫應答反應,但對不同物種C3d分子變異、結構與功能關系鮮見報道。本研究通過克隆了16種不同禽類C3d基因,表達獲得了雞C3d重組蛋白并分析了C3d分子進化與結構、功能的關系

2、,以豐富C3d的理論與應用研究。
　　首先,克隆了16種不同禽類的C3d基因,登錄Genbank并將之與哺乳動物C3d基因序列比較,進行生物信息學分析,構建基于C3d編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹,結果顯示哺乳動物與禽類分別居進化樹兩端,相距較遠,與傳統(tǒng)物種關系差異吻合;在禽類區(qū)塊內(nèi)部分化為兩個部分,但與禽類所屬目、科無關。對C3d分子進化過程的選擇情況進行分析,表明其整個基因處于純化選擇,但有8個可能發(fā)生陽性選擇的氨基酸位點。以已發(fā)

3、表的人C3d三級結構為模板,同源模建獲得16種禽類C3d的三級結構,以雞C3d結構為模板,標記陽性選擇位點位置,顯示其均處于暴露區(qū),可能對于支持抗原結合域、提供CR2結合所需能量等有重要作用。
　　其次,成功構建雞C3d的bac-to-bac桿狀病毒表達系統(tǒng),獲得pFB-C3d-BAC重組病毒,在sf9昆蟲細胞內(nèi)檢測到高效表達的C3d蛋白;應用Anti-his單抗和Anti-C3d多抗進行Western-blot和免疫熒光檢測,表

4、明重組蛋白大小約為35kD,主要為細胞內(nèi)表達,具有良好的免疫原性,為其免疫機制的研究奠定了基礎。
　　最后,采用基于寡核苷酸探針的基因芯片方法檢測了16種禽類對于禽白血病病毒(ALV)B、E、J三種亞型的感染情況,結果表明7種禽類感染了E亞型,2種禽類感染了J亞型,無明顯B亞型感染信號,結合系統(tǒng)進化和陽性選擇分析,發(fā)現(xiàn)在進化樹上相距較近的禽類染病且為同種亞型的概率較高,與臨近未染病禽類進行氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)一些變異發(fā)生在陽性選擇位