羊補體分子C3d基因的克隆及羊包蟲病基因工程亞單位疫苗的研制.pdf

1、棘球蚴病(Echinococcosis granulosis)又稱包蟲病(Hydatidosisl)，是由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)的中絳期幼蟲——棘球蚴(Echinococcus)寄生于哺乳動物臟器內所引起的一種人獸共患的流行性寄生蟲病。免疫預防接種是控制包蟲病行之有效的方法，因此研制高效、實用的新型羊包蟲病基因工程亞單位疫苗一直是國內外科學家多年來共同追求的目標。 目前，含有重組蛋白EG9

2、5的羊包蟲病基因工程亞單位疫苗取得了突破性的進展，已經(jīng)成為預防包蟲病最有前景的疫苗。但是由于重組蛋白EG95表達量偏低且不可溶，上述因素都制約了該疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)應用。近來眾多研究表明，作為補體分子C3一個裂解片段的C3d，可大幅度提高與之融合抗原的免疫原性，是一種引起研究人員廣泛關注的新型分子佐劑。 基于上述背景，本研究克隆了羊補體分子C3d基因并對羊包蟲病基因工程亞單位疫苗進行了的改造。一方面提高重組蛋白EG95的可溶性，并

3、通過串聯(lián)表達提高其表達量；另一方面，構建含三拷貝羊C3d與EG95的重組質粒，并表達融合蛋白，以圖提高重組蛋白EG95的免疫原性。 主要研究工作如下： 1.提高重組蛋白EG95的可溶性及其串聯(lián)表達通過軟件分析，選取EG95基因序列中一段長為350bp、編碼高度親水的優(yōu)勢表位的序列(EG95s)，構建了含該基因序列的原核表達載體，并進一步構建了含2拷貝、3拷貝該序列的原核表達載體，表達了重組蛋白GST-EG95s，GST-

4、2EG95s，GST-3EG95s。經(jīng)western-blotting鑒定證實上述重組蛋白均為正確表達。 2.羊補體分子C3d基因的克隆和序列分析根據(jù)已發(fā)表的羊補體分子C3d基因，設計引物，從羊肝臟組織提取總RNA，通過RT-PCR擴增出羊C3d基因，序列測定表明所擴增的基因片斷與已公布的羊C3d基因核苷酸序列同源性為99.1％，氨基酸序列完全一致。軟件分析表明羊羊C3d基因與大多數(shù)哺乳動物C3d基因核苷酸序列同源性為80％左右

5、，其中與牛C3d基因同源性為95％，揭示羊和牛在進化樹上最為接近。 3.羊C3d基因與EG95s基因的串聯(lián)及原核表達為檢驗羊C3d對EG95抗原的免疫增強作用，將EG95s基因與3拷貝羊C3d基因串聯(lián)，在每個串聯(lián)基因間加入Linker鏈，構建了原核表達載體pGEX-6P-1-EG95s-3C3d，并表達了重組蛋白GST-EG95s-3C3d。SDS-PAGE電泳和免疫印跡試驗證實該重組蛋白與預期的分子量一致，具有EG95蛋白的免