苦豆子懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其內(nèi)生真菌對宿主喹諾里西啶生物堿合成積累的影響.pdf

1、近年來，利用真菌誘導(dǎo)子刺激植物組織提高次生代謝物產(chǎn)量的研究成為熱點(diǎn)，作為一種特定的化學(xué)信號，真菌誘導(dǎo)子能快速、專一和選擇性地誘導(dǎo)植物多種特定基因的表達(dá)，尤其是活化特定的次生代謝途徑，積累次生代謝產(chǎn)物。內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織中，與植物在長期“協(xié)同進(jìn)化”過程中形成了一種穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系。愈來愈多的研究證明內(nèi)生真菌除了自身產(chǎn)生活性物質(zhì)外，還可作為生物誘導(dǎo)子來調(diào)節(jié)植物次生代謝物的產(chǎn)生，但內(nèi)生真菌促進(jìn)植物次生代謝物合成積累的機(jī)制報道較少

2、。本研宄在實驗室多年篩選苦豆子活性內(nèi)生真菌菌株和誘導(dǎo)苦豆子愈傷組織和組培苗的基礎(chǔ)上，建立苦豆子懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，篩選出有效提高苦豆子喹諾里西啶生物堿含量的內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，在此基礎(chǔ)上，初步探討苦豆子內(nèi)生真菌對宿主細(xì)胞中喹諾里西啶生物堿合成積累的影響。通過測定內(nèi)生真菌誘導(dǎo)苦豆子的生理防御反應(yīng)，揭示苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)宿主喹諾里西啶生物堿合成積累的作用機(jī)制。結(jié)果如下:
　　1、以苦豆子子葉和胚軸為材料，對苦豆子愈傷組織誘導(dǎo)和

3、繼代增殖的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，探索并建立苦豆子懸浮細(xì)胞體系。結(jié)果表明:子葉和胚軸為愈傷組織生成的最佳外植體，愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L;最佳繼代增殖培養(yǎng)基是MS+NAA1.0 mg/L+6-BA4.0 mg/L+2，4-D1.0 mg/L。以胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想材料，初始接種量在10-20％，添加3％的蔗糖，有利于懸浮細(xì)胞體系的生成。

4、>　　2、以苦豆子愈傷組織為試材，采用HPLC法建立氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和苦參堿5種單堿的分離測定的色譜方法。結(jié)果表明:色譜柱:Ultimate(R)AQ-C18(4.6μm×250 mm×5 mm);流動相:0.01 mol/L磷酸緩沖液-甲醇(50:50 V/V);檢測波長216 nm;柱溫35℃;流速1.0 mL/min。檢測愈傷組織中5種單堿含量，其中氧化槐果堿和槐定堿在愈傷組織繼代培養(yǎng)第4代含量相對較高，分別

5、為1.2056和0.1165mg/g，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，氧化苦參堿、槐果堿、苦參堿含量略有波動，大致呈下降趨勢。
　　3、從苦豆子中分離并鑒定了8株內(nèi)生真菌，分別制備滅活菌絲和菌液濃縮物，研究內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子不同種類、濃度和誘導(dǎo)時間對苦豆子無菌苗和愈傷組織的生長以及喹諾里西啶生物堿含量的影響。結(jié)果表明:8株苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子中，菌液濃縮物的誘導(dǎo)效果要強(qiáng)于滅活菌絲。菌株HMGKDF1菌液濃縮物和滅活菌絲能明顯促進(jìn)愈傷組織的生長

6、，凈生長率是對照的1.82和1.42倍;菌株NDZKDF13菌液濃縮物對苦豆子愈傷組織生物堿的合成效果明顯，生物堿含量為0.5483 mg/g，是對照的23.8倍;內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子含糖量在0.01-1.00mg/L時能夠促進(jìn)無菌苗中喹諾里西啶生物堿合成積累。
　　4、以4株高活性苦豆子內(nèi)生真菌菌液濃縮物為誘導(dǎo)子，研究其對苦豆子無菌苗生理防御反應(yīng)和喹諾里西啶生物堿積累的影響。結(jié)果表明-4株苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子均可促進(jìn)喹諾里西啶生物堿的