腫瘤相關(guān)K-ras基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)方法及血游離DNA標(biāo)本分析.pdf

1、目的:利用高保真聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立對(duì)K-ras基因7個(gè)熱點(diǎn)突變同時(shí)進(jìn)行快速篩查的技術(shù)平臺(tái)，采用多重PCR和單重PCR相結(jié)合，通過(guò)擴(kuò)增曲線和熔解曲線判斷7個(gè)熱點(diǎn)突變的存在與否，并可以對(duì)突變進(jìn)行半定量分析。檢測(cè)K-ras基因相關(guān)突變的有無(wú)，可用于對(duì)腫瘤的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)，指導(dǎo)腸癌以及其他腫瘤患者的合理用藥并對(duì)腫瘤進(jìn)行預(yù)后分析。
　　 方法:將包括K-ras基因12，13號(hào)密碼子在內(nèi)的PCR產(chǎn)物

2、克隆至PGEM-T載體，通過(guò)LB/Amp平板篩選陽(yáng)性克隆，挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA。對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增初步確定陽(yáng)性克隆并通過(guò)測(cè)序分析得到確證，獲得K-ras基因野生型質(zhì)粒模板。采用重疊延伸定點(diǎn)突變技術(shù)，得到了7種突變基因型PCR產(chǎn)物，將此7種PCR產(chǎn)物與PGEM-T載體相連接，再次轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定得到K-ras基因7種熱點(diǎn)突變的質(zhì)粒模板。進(jìn)一步設(shè)計(jì)與K-ras基因7個(gè)熱點(diǎn)突變

3、配對(duì)的3’末端硫化修飾正向引物，并在其下游設(shè)計(jì)一條公共反向引物，同時(shí)設(shè)計(jì)與野生型基因模板相配對(duì)的分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)引物，分別構(gòu)成特異性突變檢測(cè)引物與特異性野生檢測(cè)引物。對(duì)K-ras基因野生型質(zhì)粒模板和7種突變型質(zhì)粒模板，進(jìn)行高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對(duì)7對(duì)突變檢測(cè)引物的檢測(cè)特異性及敏感性進(jìn)行分析并優(yōu)化單重PCR及多重PCR的反應(yīng)條件。采集正常人以及腫瘤患者的組織或血樣標(biāo)本，通過(guò)臨床樣本對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行

4、評(píng)估，并對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行k-ras基因7個(gè)熱點(diǎn)突變的篩查。
　　 結(jié)果:在一定的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系下，特異性野生檢測(cè)引物與野生模板配對(duì)得以延伸;而與突變模板不配對(duì)則不能延伸。當(dāng)特異性突變檢測(cè)引物與突變模板配對(duì)，引物得以延伸;而與野生模板不配對(duì)則不能延伸。突變敏感性分子開(kāi)關(guān)技術(shù)對(duì)20例正常人的基因組DNA以及1份含有200例正常人基因組的DNA池標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，特異性突變檢測(cè)引物無(wú)一例有擴(kuò)增產(chǎn)物，而特異性野生引物均有擴(kuò)增產(chǎn)物，與測(cè)序結(jié)

5、果一致，證實(shí)此“分子開(kāi)關(guān)”技術(shù)的檢測(cè)特異性高。突變敏感性分子開(kāi)關(guān)對(duì)15例肺癌組織DNA標(biāo)本進(jìn)行篩查，5例經(jīng)特異性突變檢測(cè)引物擴(kuò)增后有目的產(chǎn)物;從14例腫瘤患者血漿中提取的游離DNA樣本，經(jīng)特異性突變檢測(cè)引物擴(kuò)增后3例有目的產(chǎn)物，以上腫瘤標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。由此可以看出，突變敏感分子開(kāi)關(guān)對(duì)體細(xì)胞突變的檢測(cè)具有很好的特異性及敏感性。
　　 結(jié)論:高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)可用于已知基因突變的檢測(cè)，除可用于檢測(cè)外周血白