K-ras基因12、13密碼子突變定量檢測在胰腺癌中的診斷價(jià)值研究.pdf

1、胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來胰腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，全球范圍內(nèi)每年新診斷胰腺癌27.87萬例。每年因胰腺癌死亡者估計(jì)可達(dá)26.27萬人，死亡發(fā)病比約0.94。其中，胰腺導(dǎo)管腺癌(pancrea-tic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌中最常見的組織學(xué)類型，其發(fā)病隱匿，預(yù)后差，死亡率高，治療手段有限。其平均中位生存期為6個(gè)月，5年生存率為3％-5％。手

2、術(shù)切除是現(xiàn)階段唯一能治愈胰腺癌的手段，但因?yàn)槿狈υ缙诎Y狀，懷疑胰腺癌時(shí)腫瘤已轉(zhuǎn)移或超出手術(shù)切除范圍，手術(shù)切除率僅15-20％。所以提高胰腺癌的早期診斷率以獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)是治療胰腺癌的關(guān)鍵。
　　 K-ras基因在胰腺癌組織中的突變率平均在75％-90％。突變可發(fā)生在12、13、61密碼子上，第12位密碼子的突變最為多見，其次為13位密碼子。突變可使K-ras基因處于持續(xù)的激活狀態(tài)，導(dǎo)致下游基因異常激活和蛋白表達(dá)的異常。但在某

3、些胰腺良性疾病和膽道腫瘤也可發(fā)生，在有慢性胰腺炎背景的癌前期病變?nèi)缭錾?、重度不典型增生中也有發(fā)生，突變量的多少有無差異，尚未明確。檢測K-ras的突變能否作為胰腺癌和其他腫瘤的標(biāo)記物尚有爭議。
　　 既往文獻(xiàn)報(bào)道標(biāo)本多來自胰液、十二指腸液、石蠟包埋組織、外周血、糞便，多用PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism，結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性分析法)，PCR-DSM(Direc

4、t sequencing method，DNA直接測序法)方法等檢測k-ras的突變，然而，在我們對臨床標(biāo)本進(jìn)行實(shí)際檢測時(shí)，這些方法普遍存在操作繁瑣，檢測時(shí)間過長，只能進(jìn)行定性或半定量，或者敏感性和特異性不夠的問題。限制了它們的廣泛應(yīng)用。既往報(bào)道結(jié)果顯示k-ras突變定性的檢測不能有效的區(qū)分慢性胰腺炎和胰腺癌。
　　 本研究基于實(shí)驗(yàn)室已建立的一種靈敏而準(zhǔn)確的雙熒光標(biāo)記探針聯(lián)合肽核酸鉗制PCR檢測K-ras基因突變的絕對定量技術(shù)，

5、可同時(shí)對標(biāo)本的K-ras12及13位密碼子突變進(jìn)行定量檢測，在胰腺癌細(xì)胞株、胰腺相關(guān)疾病的組織標(biāo)本、胰腺癌高危人群外周血標(biāo)本中檢測應(yīng)用，評價(jià)其檢測效率和鑒別診斷胰腺癌的能力，其突變量與臨床特征的相關(guān)性，現(xiàn)分述如下：
　　 一、胰腺癌細(xì)胞株中K-ras基因12、13密碼子突變的定量檢測
　　 目的：比較雙熒光標(biāo)記探針聯(lián)合肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR與DNA直接測序兩種檢測方法的靈敏度及準(zhǔn)確度。
　　 方法：應(yīng)用雙熒光標(biāo)

6、記探針聯(lián)合肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR檢測7株胰腺癌細(xì)胞株：SW1990、PaTu8988、CFPAC、Panc-1、ASPC、CPanc-2、BXPC-3K-ras基因12、13密碼子突變量，分析其突變情況，并同時(shí)對7株細(xì)胞株做測序。
　　 結(jié)果：雙熒光標(biāo)記探針聯(lián)合肽核酸實(shí)時(shí)定量PCR檢測K-ras基因突變的結(jié)果與測序結(jié)果一致，可檢測出k-ras12、13密碼子突變量，并且具有較高的靈敏度，還可以進(jìn)行絕對定量，證明此方法具有良好的

7、應(yīng)用性。
　　 結(jié)論：雙熒光標(biāo)記探針聯(lián)合肽核酸實(shí)時(shí)定量PCR是一種精確的、比DNA測序更敏感、能進(jìn)行絕對定量、同時(shí)檢測K-ras12、13密碼子突變的檢測方法。
　　 二、胰腺癌及胰腺相關(guān)疾病組織中K-ras12、13密碼子突變的定量檢測及意義
　　 目的：研究K-ras基因第12、13位密碼子突變在胰腺導(dǎo)管腺癌及胰腺相關(guān)疾病組織中的定量檢測及其臨床意義。
　　 方法：收集經(jīng)手術(shù)切除的130例有明確病理診

8、斷的組織樣本及臨床資料，應(yīng)用雙熒光探針聯(lián)合肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測組織DNA中k-ras基因第12、13密碼子的突變量。
　　 結(jié)果：K-ras基因第12密碼子在胰腺導(dǎo)管腺癌和其他疾病的胰腺組織中突變量有顯著差異，ROC曲線下面積為0.727(p=0.001)，定量診斷胰腺導(dǎo)管腺癌的敏感性及特異性分別為84.8％，64.0％。在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中K-ras基因第12密碼子的高突變量與生存期顯著相關(guān)，組織中13密碼子陽性率

9、及突變量均與吸煙有關(guān)。
　　 結(jié)論：K-ras12密碼子突變量的檢測對胰腺癌具有良好的鑒別診斷能力及預(yù)后價(jià)值。
　　 三、胰腺癌高危人群外周血中K-ras12、13密碼子突變的定量檢測及意義
　　 目的：研究胰腺癌高危人群外周血中K-ras基因12、13密碼子突變的定量檢測及其臨床診斷價(jià)值。
　　 方法：收集第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院門診及住院的160例胰腺癌高危人群外周血及其臨床資料，并進(jìn)行隨訪，應(yīng)用雙熒光標(biāo)

10、記探針聯(lián)合肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR檢測K-ras基因12、13密碼子的突變量，確診通過隨訪、B超、CT、MRI、EUS+FNA細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)、ERCP、胃鏡及外科手術(shù)病理。
　　 結(jié)果：共收集160例胰腺癌高危人群。高危人群最終診斷分別為：胰腺癌36例，慢性胰腺炎患者36例，膽總管結(jié)石13例，自身免疫性胰腺炎患者6例，胰腺良性腫瘤13例，其他惡性腫瘤16例，其他良性疾病患者40例。K-ras12密碼子突變診斷胰腺癌的敏感性和特異