加味達原飲對急性肝損傷濕邪內蘊證模型大鼠的治療作用研究.pdf

1、目的：
　　在中醫(yī)理論指導下，探討大鼠濕邪內蘊證模型的造模過程及檢測方法，為中醫(yī)證型動物造模方法提供理論依據(jù)。并研究加味達原飲對D-GalN及CCL4所致的濕邪內蘊證急性肝損傷實驗動物模型的治療效果及作用機制。為中醫(yī)治療急性肝損傷提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　選擇加味達原飲對D-GalN及CCL4所致的濕邪內蘊證急性肝損傷大鼠模型進行干預，檢測生化、免疫、病理、細胞通路等指標，研究達原飲治療濕邪內蘊證肝損傷大鼠的機制

2、及療效。
　　實驗一濕邪內蘊證動物模型的建立
　　SD大鼠，雌性，36只，隨機分為空白對照組組、模型1組、模型2組，每組12只。模型1組使用“常規(guī)飲食+造模箱”造模。將大鼠置于溫度28±2℃，濕度為90±5％的造模箱內飼養(yǎng)15天。造模2組使用“高脂高糖飲食+造模箱”造模。將大鼠置于溫度28±2℃，濕度為90±5%的造模箱內飼養(yǎng)15天，并同時予高脂高糖飲食。測量大鼠的飲食量、飲水量、體重、SOD、MDA。
　　實驗二加味

3、達原飲治療D-GalN所致急性肝損傷濕邪內蘊證大鼠的研究
　　SD大鼠,雌性,72只，隨機分為空白對照組、模型組、陽性（美能）組、加味達原飲低、中、高劑量組，每組12只。除空白對照組外，余各組大鼠置于溫度28±2℃，濕度90%±5%的造模箱內飼養(yǎng)15天，并同時給予高脂高糖飲食，15天后一次性腹腔注射D-GalN500mg/kg以造成急性肝損傷模型，造模后立即給予藥物灌胃治療,每日兩次，其中陽性（美能）組的日給藥量為15.75mg/

4、kg/天,加味達原飲低、中、高劑量組的日給藥量分別為：5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌藥體積為每次10ml/kg/次。造模48h后，所有大鼠股動脈采血，取血漿測ALT、AST、TB，ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6，肝組織勻漿后熒光PCR法檢測NF-КB有關信號傳導通路的p65、p50蛋白的表達。處死動物，取肝右葉作常規(guī)HE切片，光鏡下觀察其變化。
　　實驗三加味達原飲治療CC

5、L4所致急性肝損傷濕邪內蘊證大鼠的研究
　　SD大鼠,雌性,72只，隨機分為空白對照組、模型組、陽性（美能）組、加味達原飲低、中、高劑量組，每組12只。除空白對照組外，余各組大鼠置于溫度28±2℃，濕度90%±5%的造模箱內飼養(yǎng)15天，并同時給予高脂高糖飲食，15天后一次性腹腔注射CCL4原液1ml/kg體重以造成急性肝損傷模型，造模后立即給予藥物灌胃治療,每日兩次，其中陽性（美能）組的日給藥量為15.75mg/kg/天,加味達原

6、飲低、中、高劑量組的日給藥量分別為：5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌藥體積為每次10ml/kg。造模48h后，所有大鼠股動脈采血，取血漿測ALT、AST、TB，比色法檢測SOD、MDA,ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6，肝組織勻漿后熒光PCR法檢測NF-КB相關信號傳導通路的p65、p50蛋白的表達。處死動物，取肝右葉作常規(guī)HE切片，光鏡下觀察其變化。
　　結果：
　　1

7、.濕熱內蘊證動物模型的造模結果
　　造模后15天，模型1組飲食量、體重有明顯的下降，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。飲水量與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。SOD、MDA與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型2組大鼠的飲食量、飲水量、體重、SOD明顯下降,與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MDA明顯升高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。<

8、br>　　2.加味達原飲對D-GalN所致急性肝損傷濕邪內蘊證大鼠的治療作用
　?。?）造模后48h，模型組ALT、AST、TB含量明顯升高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組，達原飲中、高劑量組ALT、AST、TB降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；加味達原飲低劑量組ALT下降，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　（2）造模后48h，模型組血漿TNF-α

9、、IL-1、IL-6含量明顯增高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組、加味達原飲中、高劑量治療組血漿TNF-α、IL-1、IL-6明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低劑量組的TNF-α、IL-1、IL-6含量有所下降，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　?。?）NF-κBp50，NF-κBp65mRNA檢測結果：模型組NF-κBp50，NF-κBp65mRN

10、A的表達明顯增高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組、加味達原飲中、高劑量治療組NF-κBp50，NF-κBp65mRNA表達明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低劑量組NF-κBp50，NF-κBp65mRNA表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　?。?）肝組織HE染色檢測結果顯示：空白對照組肝竇肝索結構清楚，肝細胞胞質豐富，核大而圓。模型組肝細胞片狀壞死，

11、或碎屑狀壞死，肝細胞濁腫。加味達原飲低劑量組肝細胞廣泛水腫，可見點狀壞死和小灶區(qū)脂肪變性和點狀肝細胞再生。陽性（美能）組，加味達原飲中、高劑量組肝細胞廣泛濁腫，可見點狀壞死。脂肪變性不明顯。
　　3.加味達原飲對CCL4所致急性肝損傷濕邪內蘊證大鼠的治療作用
　　（1）造模后48h，模型組ALT、AST、TB含量明顯升高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組，加味達原飲中、高劑量組ALT、AST

12、、TB降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；加味達原飲低劑量組ALT下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　（2）造模后48h，模型組SOD降低，MDA升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組、加味達原飲中、高劑量組的SOD升高，MDA下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；加味達原飲低劑量組SOD升高，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。<

13、br>　?。?）造模后48h，模型組血漿TNF-α、IL-1、IL-6含量明顯增高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味達原飲中、高劑量組的TNF-α下降，與模型組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組、加味達原飲高劑量組IL-6下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　（4）NF-κBp50，NF-κBp65mRNA檢測結果：模型組NF-κBp50，NF-κBp65mRNA的表達明

14、顯增高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性（美能）組、加味達原飲中、高劑量治療組NF-κBp50，NF-κBp65mRNA表達明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低劑量組NF-κBp50，NF-κBp65mRNA表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　?。?）肝組織HE染色檢測結果顯示：空白對照組肝竇肝索結構清楚，肝細胞胞質豐富，核大而圓。模型組肝細胞點狀壞死，有廣泛的肝

15、細胞水腫，明顯脂肪變性。加味達原飲低劑量組可見肝細胞部分水腫，脂肪變性和灶區(qū)肝細胞再生。陽性（美能）組，加味達原飲中、高劑量組見肝細胞水腫，點狀肝細胞再生，肝細胞脂肪變性較模型組輕。
　　結論
　　1.“高脂高糖飲食+造模箱”和“常規(guī)飲食+造模箱”都可造成濕邪內蘊證動物模型。且造成的大鼠模型偏于濕熱內蘊證。造模后大鼠的行動、體重、飲食量、飲水量都有明顯改變。但“高脂高糖飲食+造模箱”造模方法的效果更顯著，造模后大鼠不僅一般表

16、現(xiàn)發(fā)生明顯改變，且測量后顯示SOD、MDA發(fā)生改變。這與中醫(yī)的內外因致病的理論相一致。
　　2.加味達原飲中、高劑量治療組均能顯著減輕D-GalN所致濕邪內蘊證大鼠的肝細胞損傷，降低血漿中ALT、AST、TB含量，具有較好的保肝降酶作用。加味達原飲中、高劑量治療組能顯著改善急性肝損傷濕邪內蘊證大鼠肝組織的病理變化，縮小病變面積，減輕肝細胞病變程度。并可降低機體一系列的細胞因子，通過調節(jié)機體的免疫反應而起到保肝作用。加味達原飲低劑量

17、組也有一定的保肝降酶作用，但其各指標結果之間差異較大，效果較難評價。
　　3.加味達原飲的中、高劑量組可明顯減輕CCL4所致濕邪內蘊證大鼠的肝細胞損傷，降低血漿中ALT、AST、TB含量，具有較好的保肝降酶作用。并可對SOD、MDA及TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子起到調節(jié)作用，并可調節(jié)NF-κBp50，NF-κBp65的表達，通過抑制機體的脂質過氧化反應、免疫調節(jié)等多重功效而發(fā)揮保肝作用。加味達原飲低劑量組保肝作用不明顯