大鼠SHCs移植對急性肝損傷的影響.pdf

1、研究證實，肝臟干/祖細(xì)胞的激活與增殖，發(fā)生在各種原因引起的肝臟損傷中，參與器官、組織的發(fā)育與修復(fù)，具有向成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化的雙向潛能。對于肝干細(xì)胞（HSC）的研究為肝臟疾病的細(xì)胞移植、肝臟組織工程和基因治療提供了新的思路。但正常情況下體內(nèi)的HSC池的細(xì)胞很少，總數(shù)保持相對穩(wěn)定，其中小肝細(xì)胞（SHCs）作為一種分化相對成熟的HSC，約占肝細(xì)胞的1.5％～2.0％。肝細(xì)胞本身對于肝組織缺失和(或)各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞壞死具有反應(yīng)性

2、增殖并修復(fù)肝組織能力。但當(dāng)肝臟損傷達到一定程度或肝細(xì)胞增殖受到抑制時，肝組織的修復(fù)將依賴于存在于門靜脈或其周圍區(qū)域分化程度較低的所謂的肝臟干細(xì)胞。當(dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷后，HSC激活，HSC池的細(xì)胞數(shù)增多。近些年，干細(xì)胞移植應(yīng)用于治療各種終末期肝病，成為最具吸引力的研究熱點。本實驗中利用DEN成功制造大鼠肝硬化SHCs增殖模型，分離并鑒定這群SHCs，建立一種簡單有效的SHCs分離培養(yǎng)方法。這群細(xì)胞形態(tài)、表型都具有肝干/祖細(xì)胞特征并觀察SH

3、Cs移植對急性肝損傷的影響，為HSC基礎(chǔ)和臨床研究提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1．探討SHCs增殖模型的建立，體外分離、培養(yǎng)大鼠SHCs的方法，并對其進行表型鑒定。
　　2．探討經(jīng)門靜脈移植SHCs對大鼠CCl4＋2/3肝切所致急性肝損傷的影響。
　　方法：
　　1．選擇健康SD大鼠20只，飼喂含DEN的飼料建立SD大鼠肝硬化SHCs增殖模型。采用改進后兩步膠原酶灌注消化法分離細(xì)胞。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

4、電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。采用計數(shù)法測定細(xì)胞生長曲線,FCM測定細(xì)胞周期。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色進行表型鑒定。
　　2．SHCs行PKH26膜熒光染色。將實驗用同一近交系SD大鼠30只隨機平均分成空白對照組（B）、損傷造模組(M)和SHCs移植組(T)。B組腹腔注射生理鹽水，M組、T組腹腔注射CCl4。24h后戊巴比妥腹腔麻醉，消毒開腹，M、T組行2/3肝切，B、M組門靜脈注入生理鹽水，T組門靜脈注入經(jīng)膜熒光標(biāo)記的SHCs懸液。

5、
　　3．4wk后，采血測血清ALT、AST，并取病理標(biāo)本做冰凍切片熒光顯微鏡下觀察及HE染色普通光鏡下觀察。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的SHCs24h內(nèi)即可見貼壁伸展，48h左右克隆形成，5d鋪滿瓶底。光鏡下可觀察SHCs核仁小而清晰，胞質(zhì)少，細(xì)胞體積較??；電鏡下可見細(xì)胞體積較小，約為正常肝細(xì)胞1/3～2/3，表面少量短小的微絨毛突起，核漿比高。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察SHCs胞質(zhì)AFP染色呈棕黃色陽性信號，陽性率較高，

6、細(xì)胞胞質(zhì)CK19、CK8、CK7、CK18染色呈棕黃色陽性信號。
　　2.冰凍切片熒光顯微鏡下可以觀察到由SHCs分化而來的肝細(xì)胞形成的肝板結(jié)構(gòu)，參與肝臟組織的再生與修復(fù)。T組冰凍切片熒光顯微鏡下可以觀察到由SHCs分化的肝細(xì)胞形成的肝板結(jié)構(gòu)。
　　3.三組血清ALT、AST水平差異明顯，B組ALT為（13.67±9.74）U/L、AST為（13.49±9.39）U/L；M組ALT為（270.90±11.57）U/L、AST

7、為（222.75±17.49）U/L，顯著高于B組（P<0.01）；T組ALT為（149.60±12.35）U/L、AST為（160.12±17.56）U/L，顯著高于B組（P<0.01），顯著低于M（P<0.01）。經(jīng)門靜脈移植SHCs能有效降低CCl4＋2/3PH致急性肝損傷血清ALT和AST水平，三組差異有非常顯著意義。
　　4.M、T兩組肝臟病理損傷程度差異明顯。M組病理顯示：大量炎細(xì)胞浸潤，大面積肝細(xì)胞壞死，部分肝板結(jié)構(gòu)