水溶性低分子量殼聚糖輻射防護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：制備水溶性低分子量殼聚糖,并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其輻射防護(hù)作用的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；合成WSC-DTPA,并將其制成納米粒,為研究新型錒系元素的促排藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：通過(guò)間歇3h的高溫強(qiáng)堿洗脫法提高殼聚糖的脫乙酰度,再通過(guò)乙酸.過(guò)氧化氫氧化降解法降低其分子量,制備出水溶性低分子量殼聚糖；采用MTT法檢測(cè)不同濃度殼聚糖對(duì)4 Gy60Coγ射線照射后大鼠正常肝細(xì)胞(BRL)存活率的影響；流式細(xì)胞儀PI單染法檢測(cè)BRL細(xì)

2、胞經(jīng)殼聚糖及4 Gy60Coγ射線共同作用后細(xì)胞周期分布的變化；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)不同濃度殼聚糖對(duì)4Gy60Coγ射線照射后BRL細(xì)胞凋亡的影響；Flou-3AM檢測(cè)上述條件處理前后BRL細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化；克隆形成實(shí)驗(yàn)分析不同濃度殼聚糖聯(lián)合不同照射劑量對(duì)LO2細(xì)胞生存率的影響,以多靶單擊數(shù)學(xué)模型擬合方程計(jì)算不同濃度殼聚糖對(duì)各組細(xì)胞的保護(hù)系數(shù)(PF)并評(píng)價(jià)其輻射防護(hù)效果；通過(guò)N-酰化反應(yīng)合成WSC-

3、DTPA聚合物,離子凝膠法制備WSC-DTPA納米粒,并對(duì)其結(jié)構(gòu)及形態(tài)進(jìn)行表征。
　　 結(jié)果：線性電位滴定法測(cè)定經(jīng)間歇3 h高溫強(qiáng)堿洗脫法獲得的殼聚糖的脫乙酰度由原來(lái)的79.3％±0.55％提高到了94.1％±0.06％。高效液相色譜法測(cè)定了原料殼聚糖的分子量為2.00×105,經(jīng)乙酸-H2O2降解法降解120 min后,殼聚糖的分子量下降為3.26×103。傅里葉變換紅外光譜證明我們確實(shí)得到了高脫乙酰度低分子量的殼聚糖。MTT

4、法結(jié)果表明,在給藥濃度范圍內(nèi)(1.56～50μg/mL)低分子量殼聚糖(LMWC)對(duì)BRL細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用,且能夠?qū)馆椛鋵?duì)BRL細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制,50μg/mL的CS可以使4 Gy60Coγ射線照射后培養(yǎng)24 h BRL,細(xì)胞的存活率由77.4％±0.19％提高到90.6％±0.15％(p<0.05),培養(yǎng)48 h BRL細(xì)胞的存活率由66.5％±0.19％提高到87.5％±0.16％(p<0.05)。流式細(xì)胞儀PI單染法結(jié)果表明,4

5、Gy60Coγ射線照射后BRL,細(xì)胞的SubG1峰與對(duì)照組相比明顯升高(p<0.05),而加入殼聚糖組隨著殼聚糖濃度的升高SubG1峰逐漸降低,藥物濃度為50μg/mL組與單純照射組相比SubG1峰由51.93％±2.11％降至16.91％±1.32％(p<0.05)。流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Flou-3AM檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化,結(jié)果表明,殼聚糖能夠抑制BRL細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)鈣超載,細(xì)胞凋亡率

6、由未加藥時(shí)的16.17％±0.38％降至藥物濃度為50μg/mL時(shí)的7.09％±0.48％,胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度由未加藥時(shí)的22.83±0.25降至藥物濃度為50μg/mL,時(shí)的14.0±0.23,差異均有顯著性(p<0.05)。且細(xì)胞凋亡率與胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=1.03x-7.47,R2=0.9994。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各加藥組的PF值均大于1。以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的,即水溶性低分子量殼聚糖對(duì)4 G

7、y60Coγ射線照射后正常肝細(xì)胞具有輻射防護(hù)作用。紅外光譜及核磁共振氫譜均證實(shí)通過(guò)N-?；磻?yīng)成功合成了WSC-DTPA；納米激光粒度儀測(cè)得經(jīng)離子凝膠法制備的WSC-DTPA納米粒平均粒徑為46.5±1.51 nm,PDI=1.0,透射電鏡及掃描電鏡證實(shí)其為近球形,粒徑均一。
　　 結(jié)論：通過(guò)強(qiáng)堿洗脫法及乙酸-過(guò)氧化氫氧化降解法成功地制備了水溶性低分子量殼聚糖(D.D=94.1％,降解120 min Mw=3.26×103),且