十二指腸鉤蟲錳超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)的生物信息學(xué)分析、表達(dá)及其活性研究.pdf

1、[目的]
　　 本論文在課題組前期分離獲得十二指腸鉤蟲錳超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因序列的基礎(chǔ)上,對(duì)推導(dǎo)的AdMn-SOD氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;進(jìn)一步構(gòu)建AdMn-SOD成熟蛋白原核表達(dá)系統(tǒng),在大腸桿菌(E.coli)中融合表達(dá)AdMn-SOD,并分析純化的重組AdMn-SOD的活性及溫度、pH值對(duì)活性的影響。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究AdMn-SOD的生物學(xué)功能并探討其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]

2、>　　 1.AdMn-SOD的生物信息學(xué)分析
　　 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件DNASTAR及DNAMAN分析前期獲得的AdMn-SOD基因序列的閱讀框(ORF);運(yùn)用在線軟件SignalIP3.0及TargetP program(http://www.cbs.dtu.dk/services)分別預(yù)測(cè)推測(cè)的AdMn-SOD的信號(hào)肽序列及其亞細(xì)胞定位;運(yùn)用在線生物信息學(xué)軟件BLAST搜索AdMn-SOD基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在Ge

3、nBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的同源性序列;在www.expasy.ch/Tools/protparam.html中分析推測(cè)的AdMn-SOD理化性質(zhì);在http://npsa-pbil.ibcp.fr上選用HNN法對(duì)推測(cè)的AdMn-SOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)和折疊類型進(jìn)行預(yù)測(cè);在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterproSCAN/中搜索推測(cè)的AdMn-SOD的功能域;運(yùn)用CLU

4、STAL W程序比對(duì)分析AdMn-SOD與其它已報(bào)道線蟲及部分代表性物種的Mn-SOD氨基酸序列;運(yùn)用MEGA3.1軟件中鄰近法(neighbor-joining method)分析基于Mn-SOD氨基酸序列的AdMn-SOD與其它線蟲及部分代表性物種Mn-SOD的進(jìn)化樹關(guān)系。
　　 2.AdMn-SOD的原核表達(dá)
　　 設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增 AdMn-SOD成熟蛋白編碼序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) BamH I和HindⅢ雙酶切后與表達(dá)

5、載體pET-32a連接,構(gòu)建重組原核表達(dá)重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/AdMn-SOD轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表達(dá)情況。
　　 3.重組AdMn-SOD的活性檢測(cè)
　　 誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白用Ni親和層析進(jìn)行純化,用Bradford法測(cè)定純化蛋白的濃度,用超氧化物岐化酶檢測(cè)試劑盒WST-1檢測(cè)重組蛋白AdMn-SOD的超氧化物抑制百分率,測(cè)定其酶活性的單位

6、,并分析溫度、pH值對(duì)活性的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1.AdMn-SOD的生物信息學(xué)分析
　　 推導(dǎo)AdMn-SOD cDNA完整ORF為648bp,編碼216個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。AdMn-SOD包含有保守的與錳離子結(jié)合的3個(gè)組氨酸殘基及1個(gè)天冬氨酸殘基(His-46,His-94,Asp-178,His-182),具有Mn-SOD具有的"DVWEHAYY"保守結(jié)構(gòu)。AdMn-SOD前端20個(gè)氨基酸殘基

7、組成信號(hào)肽序列,第21～216個(gè)氨基酸序列為其蛋白序列;經(jīng)用TargetP預(yù)測(cè),AdMn-SOD位于線粒體中。
　　 用BLAST N及BLAST P程序在GenBank中檢索相似性序列,結(jié)果顯示AdMn-SOD基因序列及其推導(dǎo)的編碼蛋白與秀麗小桿線蟲、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergri)及中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinenMs)等線粒體Mn-SOD具有較高相似性。與其它線蟲及部分代表

8、性物種的Mn-SOD氨基酸序列比較及進(jìn)化樹研究表明,AdMn-SOD具有Mn-SOD的保守結(jié)構(gòu),且與線蟲Mn-SOD親緣關(guān)系較近。
　　 2.AdMn-SOD的原核表達(dá)
　　 運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了AdMn-SOD的成熟蛋白編碼序列,并成功構(gòu)建了pET32a/AdMn-SOD原核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/AdMn-SOD轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后,IPTG能誘導(dǎo)目的蛋白AdMn-S

9、OD在大腸桿菌BL21(DE3)中高效地可溶性表達(dá)。優(yōu)化條件下可獲純化的重組AdMn-SOD可溶性目的融合蛋白量達(dá)44.4mg/ml。
　　 3.重組AdMn-SOD的活性檢測(cè)
　　 純化的重組AdMn-SOD活性(抑制率％)為95.5,酶活性單位為3169u/mg。pH值在6.5和9.5之間對(duì)其活性影響不大,其最適pH為8.5;隨溫度的升高,其活性逐漸降低,在90℃仍存在40%以上活性,因此可知重組AdMn-SOD對(duì)溫