水蕨中含鐵型超氧化物岐化酶Fe-SOD基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、蕨類植物,由于其獨特的演化位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)的多樣性,在植物界具有非常重要的地位。其中,水蕨被用作研究遺傳,生物學,細胞學,分子生物學的模式物種。近年來,蕨類植物越來越受到人們的關(guān)注,隨著分子生物學技術(shù)在種子植物中應(yīng)用不斷的完善和成熟,人們也開始用這方面的方法和技術(shù)探究蕨類植物生長發(fā)育和代謝的分子機制。本文正是在這樣的背景下,從分子水平上對水蕨進行研究,應(yīng)用基因工程技術(shù),采用RACE方法克隆了水蕨的Fe-SOD基因,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行表達。

2、并對表達蛋白進行了純化,鑒定。同時,通過脅迫水蕨配子體在不同環(huán)境的生長,檢測水蕨中Fe-SOD的功能。
　　 本研究通過簡并引物,首先從水蕨中得到一個458bp的Fe-SOD核心片段。再通過RACE的方法,分別進行5’RACE和3’RACE,得到5’和3’兩個亞克隆,分別獲取了382bp的5’端片段和691bp的3’端片段。最后通過已知的序列設(shè)計特異性引物,克隆得到1212bp的Fe-SOD的完整序列,該序列編碼266個氨基酸。

3、
　　 通過生物信息學分析可以看出,此Fe-SOD的核酸序列與其他植物的序列具有較高的同源性。該酶的氨基酸序列中含3個Fe-SOD的保守序列:FNNA、FGSGW、WEHAYY。同時與其他植物的Fe-SOD氨基酸序列也具有很高的同源性。
　　 將該Fe-SOD目的片段與pET32a載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,之后用1mM的IPTG誘導(dǎo)6h,表達形成一個大小43KD的蛋白,與預(yù)計大小符合。得到的重組蛋白經(jīng)過純化后制備

4、抗體,將該抗體應(yīng)用于檢測水蕨逆境脅迫下的Fe-SOD的表達。
　　 水蕨配子體在低溫脅迫4℃下持續(xù)處理72小時候后,通過Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn),在8小時到12小時之間,Fe-SOD的表達量達到最高,而此后驟然下降,說明當植物在寒冷環(huán)境下時,Fe-SOD在發(fā)揮作用,隨著脅迫時間的延長表達量增大,但是當24小時候后,表達量明顯下降,因為此時水蕨配子體的整體開始萎蔫。而72小時候,部分的配子體已經(jīng)死亡或停止生長,所以

5、此時Fe-SOD的表達量也已經(jīng)非常小了。也就是說,Fe-SOD在一定時間內(nèi)可以幫助植物抵御不良環(huán)境,但并不能長時間有效。
　　 水蕨配子體在不同的光照脅迫下處理24小時候后,雖然這些配子體從外形來看并沒有明顯差異,但通過Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn),無論配子體處于是低光照還是高光照條件下,Fe-SOD的表達量都有所上升,而在培養(yǎng)箱光照強度下,Fe-SOD的表達量相對較小,說明光照過高或者過低對植物體來說都是一種不良的

6、刺激,低光照會導(dǎo)致光照不足,而高光照會造成光抑制。在這樣的情況下植物體內(nèi)會過多的產(chǎn)生氧自由基。此時Fe-SOD發(fā)揮作用清除植物體內(nèi)由于受到過強或過低光照而產(chǎn)生的氧自由基,故而表達量增高,以保護細胞免受傷害,幫助植物抵御不良環(huán)境。
　　 蕨類植物作為植物界中重要過渡的類群,是研究進化不可缺少的重要環(huán)節(jié)。另外,蕨類植物中還有許多非常重要植物類群,有的是珍貴的藥用植物,有的是特殊的抗逆植物,研究這些蕨類植物的功能基因以及代謝途徑對醫(yī)學