膀胱尿路上皮癌DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)甲基化的研究.pdf

1、膀胱癌(bladder cancer，BC)是世界上發(fā)病率第六位的惡性腫瘤，在我國(guó)是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中尿路上皮癌(urothelial cell carcinoma，UCC)占90％左右，是膀胱癌主要的組織學(xué)類型。膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma,BUCC)的顯著特點(diǎn)是大約75-85％的初發(fā)病例都是表淺性腫瘤(Tis，Ta，T1)，超過(guò)50％的患者會(huì)出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，除此之外，約

2、40％的患者其腫瘤的惡性程度會(huì)增加，而最終將有30％的患者將死于膀胱癌。BUCC的高復(fù)發(fā)率和進(jìn)展性、術(shù)后的膀胱灌注化療和全身化療以及長(zhǎng)期甚至終身的隨訪觀察，無(wú)疑給患者帶來(lái)身心上的巨大痛苦、增加其醫(yī)療費(fèi)用，也給國(guó)家的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)增加了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。
　　 目前BUCC的診斷和監(jiān)測(cè)主要依靠膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)(urinecytology)等檢查手段，膀胱鏡檢查屬于有創(chuàng)性檢查，不可避免的會(huì)給患者造成創(chuàng)傷和痛苦，而尿脫落細(xì)胞學(xué)的

3、陽(yáng)性率極低，幾乎不能作為一個(gè)較敏感和適宜的早期診斷的指標(biāo);在治療方面，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和輔助化療的效果欠佳，BUCC的治療期待著更有效的方案。因此，研究BUCC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)機(jī)制，從分子水平上揭示膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，探索BUCC的早期診斷、預(yù)后估計(jì)的無(wú)創(chuàng)性敏感指標(biāo)以及基因靶向治療的理論基礎(chǔ)和可能方案，從而提高膀胱癌的臨床診療水平，是泌尿外科臨床和科研上急需解決的熱點(diǎn)和重要課題。
　　 近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤

4、抑制基因(即抑癌基因，tumoursuppressor gene，TSG)啟動(dòng)子區(qū)CpG島(CpG island，CGI)甲基化是該基因失活的重要機(jī)制，能使該基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，被認(rèn)為與許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系。CpG島異常甲基化是Knudson's“二次打擊論”的重要內(nèi)涵，也是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。死亡相關(guān)蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)基因是腫瘤抑制基因之一，定位于染

5、色體9q34.1，是一種鈣離子(Ca2+)/鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò)一系列通路參與誘導(dǎo)凋亡的正向調(diào)節(jié)，在凋亡途徑中起重要作用。DAPK在多種腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)缺失，且該表達(dá)缺失與其CpG島的甲基化改變密切相關(guān)，因此被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　 國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織和細(xì)胞中DAPK表達(dá)低下或缺失，而其基因啟動(dòng)子的甲基化水平則明顯高于正常膀胱粘膜組織和細(xì)胞，在膀胱癌患者的尿液標(biāo)本中可檢測(cè)

6、到DAPK基因啟動(dòng)子的甲基化，且其敏感度優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。國(guó)內(nèi)學(xué)者胡禮炳等和趙敏等分別研究DAPK啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與膀胱癌的關(guān)系，得出的結(jié)論卻基本相反。胡禮炳等認(rèn)為DAPK的表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系，并且基因啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)DAPK基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，DAPK基因的甲基化與腫瘤浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)有顯著的相關(guān)性，提示DAPK甲基化可以作為腫瘤預(yù)后的一個(gè)分子指標(biāo);而趙敏等認(rèn)為DAPK基因啟動(dòng)子在膀胱癌中的甲基化陽(yáng)性

7、率較低，且與膀胱癌的分級(jí)、分期無(wú)相關(guān)性，因而在選擇分子生物學(xué)指標(biāo)輔助膀胱癌早期診斷時(shí)，DAPK的甲基化檢測(cè)需慎用。
　　 本研究在臨床標(biāo)本與體外細(xì)胞兩個(gè)水平研究膀胱尿路上皮癌DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子異常甲基化的意義及其機(jī)制，探討DAPK與BUCC的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)、DAPK作為BUCC的早期診斷和預(yù)后估計(jì)的敏感指標(biāo)，以及基因靶向治療的理論基礎(chǔ)和可能方案。本研究分為三個(gè)部分:第一部分采用Western-blot，RT-PCR和

8、MS-PCR分別檢測(cè)膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中 DAPK，DAPK mRNA的表達(dá)，以及DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，探究DAPK基因的表達(dá)與甲基化改變與BUCC的關(guān)系及其機(jī)制，以及與BUCC腫瘤臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系。第二部分選擇人尿路上皮癌細(xì)胞5637進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，將5637細(xì)胞分為2組，即膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637組（對(duì)照組）和膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637+5-Aza-CdR處理組(觀察組），分別采用Weste

9、rn-blot方法、RT-PCR方法定量檢測(cè)對(duì)照組和觀察組中DAPK、DAPK mRNA的表達(dá)，并采用MS-PCR方法檢測(cè)對(duì)照組和觀察組中DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，分析膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)。第三部分采用流式細(xì)胞術(shù)和腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637組（對(duì)照組）及膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組）的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞侵襲能力，研究DAPK基因與腫

10、瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能之間的關(guān)系。
　　 第一部分 DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化改變?cè)谌税螂啄蚵飞掀ぐ┙M織中的意義
　　 目的:分析DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化改變?cè)谌税螂啄蚵飞掀ぐ┙M織中的意義。
　　 方法:采用Western-blot方法定量檢測(cè)膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK的表達(dá)，采用RT-PCR方法定量檢測(cè)膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK mRNA的表達(dá)，并采

11、用MS-PCR方法檢測(cè)膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:Western-blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPK在BUCC組織中表達(dá)顯著低于正常組織(P＜0.01)，且DAPK的表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、分期無(wú)顯著相關(guān)性。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPK mRNA在BUCC組織中表達(dá)顯著低于正常組織(P＜0.01)，且與腫瘤的分級(jí)分期無(wú)顯著相關(guān)性，與Western-blot檢測(cè)的DAPK

12、表達(dá)結(jié)果一致。MS-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BUCC組織中有16例檢測(cè)到DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化改變(16/21，76.2％)，在正常組織中有4例檢測(cè)到DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化改變(4/20，20％)，兩者之間具有顯著性差異(P＜0.01)。DAPK基因的甲基化改變與腫瘤病理分級(jí)、臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性，但與肉眼血尿有關(guān)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:(1) DAPK基因的表達(dá)缺失及其啟動(dòng)子CpG島的甲基化與BUC

13、C的發(fā)生密切相關(guān)。(2) DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化與肉眼血尿有顯著的相關(guān)性，提示具有肉眼血尿的患者可能預(yù)后不良。
　　 第二部分人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究
　　 目的:研究人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中DAPK基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，以及5-Aza-CdR對(duì)DAPK基因甲基化狀態(tài)的影響。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)選擇人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。將5637細(xì)

14、胞分為2組，即膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637組（對(duì)照組）和膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組），分別采用Western-blot方法、RT-PCR方法定量檢測(cè)對(duì)照組和觀察組中DAPK、DAPK mRNA的表達(dá)，并采用MS-PCR方法檢測(cè)對(duì)照組和觀察組中DAPK基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:對(duì)照組5637細(xì)胞中DAPK、DAPK mRNA的表達(dá)水平極低，啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)為陽(yáng)性，而觀察組

15、5637細(xì)胞中DAPK，DAPKmRNA的表達(dá)水平明顯增高，啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)為陰性。
　　 結(jié)論:(1) DAPK基因的表達(dá)異常與膀胱尿路上皮癌細(xì)胞關(guān)系密切，且基因啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)DAPK基因的表達(dá)中起重要作用。(2)5-Aza-CdR可以抑制基因的甲基化，從而逆轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，提示其可能作為一種治療腫瘤的基因靶向治療藥物。
　　 第三部分人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞DAPK基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與生物學(xué)功能

16、之間的關(guān)系分析
　　 目的:探討人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞DAPK基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與生物學(xué)功能之間的關(guān)系。
　　 方法:采用流式細(xì)胞術(shù)和腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637組（對(duì)照組）及膀胱尿路上皮癌細(xì)胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組）的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞侵襲能力。
　　 結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增高。腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組的細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組