TGF-β在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的表達及其保護機制的研究.pdf

1、目的：
　　 青光眼是嚴重損害視力的常見致盲眼病,青光眼患者視功能的損害是視神經(jīng)纖維損傷并導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡的結(jié)果。研究認為,逆行運輸阻滯、多種營養(yǎng)因子缺乏、缺血以及興奮性氨基酸的毒性作用等可能是引發(fā)凋亡的因素。因此,治療青光眼的最終目的是預防視神經(jīng)的損害和RGCs的凋亡。
　　 目前視神經(jīng)保護的方法有:(一)改善視乳頭微循環(huán),(二)谷氨酸受體拮抗劑的應用,(三)一氧化氮途徑抑制劑,(四)提供神經(jīng)營養(yǎng)因

2、子,(五)抗凋亡治療,(六)熱休克蛋白應用,(七)促紅細胞生成素,等。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β是近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的生長因子家族,哺乳動物中TGF-β1含量最高。TGF-β1生物學作用廣泛,在胚胎形成、細胞生長、分化、血管形成、腫瘤增殖、傷口愈合、炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)等方面都有重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中,TGF-β1還具有抑制神經(jīng)元凋亡,促進神經(jīng)元軸突生長,促進神經(jīng)元存活和分化等作用。TGF-β1與其它神經(jīng)營養(yǎng)因子相互作用可以

3、促進神經(jīng)元存活。在腦損傷性疾病中,TGF-β1還有充當神經(jīng)保護劑、抑制細胞凋亡的作用,腦組織缺氧缺血性損傷后,細胞凋亡增加,Bcl-2/Bax比值下降,TGF-β1干預后可調(diào)控Bcl-2及Bax蛋白表達,使Bcl-2/Bax比值升高,TGF-β1可以通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達,起神經(jīng)細胞保護作用。目前,已知此保護作用的途徑包括降低Ca2+濃度,穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣及增加Bcl-2相關(guān)死亡因子Bad磷酸化,減少Bad蛋白表達。
　　

4、 Bcl-2基因家族成員是細胞凋亡途徑中的重要調(diào)節(jié)因子,Bcl-2和Bax調(diào)控細胞凋亡,Bcl-2抑制凋亡,Bax促進凋亡。近年研究提示,細胞凋亡不僅取決于Bcl-2和Bax自身表達的高低,還與Bcl-2/Bax的比值有關(guān),細胞內(nèi)Bcl-2和Bax的比值是決定細胞凋亡與否的一個很敏感的指標,Bcl-2與Bax的比值決定著細胞受誘導刺激后是凋亡還是存活,比值增加,細胞趨于存活,比值下降,細胞趨于凋亡。研究表明,急性高眼壓大鼠隨著視網(wǎng)膜神經(jīng)

5、節(jié)細胞的凋亡,Bcl-2/Bax下降。目前研究也明確顯示,Bcl-2的表達能夠阻止或減少視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。
　　 Smad蛋白家族是目前發(fā)現(xiàn)的TGF-β1唯一的底物,是把TGF-β1受體信號從胞質(zhì)傳導到細胞核內(nèi)的中介分子。TGF-β1多種功能的發(fā)揮均依賴Smad蛋白的信號轉(zhuǎn)導及調(diào)控。Smad4在TGF-β1-Smad信號轉(zhuǎn)導中處于中樞環(huán)節(jié),能與活化的受體Smads形成多元復合體,通過特定的穿梭機制進入細胞核中與轉(zhuǎn)錄激活或

6、轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用,進而調(diào)節(jié)靶基因的表達。
　　 NF-κB又稱核轉(zhuǎn)錄因子,是一種廣泛存在于體內(nèi)各種細胞的核轉(zhuǎn)導因子。作為一種多向性調(diào)節(jié)蛋白,NF-κB可以介導細胞存活信號,防止細胞凋亡。各種研究表明,細胞抗凋亡作用的啟動信號仍然是各種生存因子通過受體激酶的介導,激發(fā)以NF-κB為中心的正向級放大的信號轉(zhuǎn)導通路,促使NF-κB調(diào)控的抗凋亡基因如Bcl-2家族成員等的激活及Caspase-9等的凋亡。
　　 目前,國內(nèi)外

7、尚未有TGF-β1在慢性高眼壓大鼠RGCs中的表達以及TGF-β1在青光眼中的抗凋亡作用的研究。為了探討TGF-β1在青光眼中的表達及其抗凋亡作用途徑,本課題應用TGF-β11抗體、TGF-β1抗原分別干預慢性高眼壓大鼠,檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞TGF-β1、Bcl-2和Bax的表達,以及檢測TGF-β1信號轉(zhuǎn)導途徑中Smad4和NF-κB的表達,以期證實TGF-β1在青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的抗凋亡作用,為青光眼的治療提供一定依據(jù)。

8、>　　 研究方法：
　　 一、TGF-β1在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的表達及其抗凋亡作用
　　 采用免疫組化和ReALTime PCR法檢測正常組、普通高眼壓組、TGF-β1抗體干預高眼壓組大鼠RGCs中TGF-β1的表達。采用TUNEL法檢測普通高眼壓組和TGF-β1抗體干預高眼壓組中RGCs凋亡并計數(shù)。
　　 二、TGF-β1對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bcl-2和Bax表達的影響
　　

9、采用免疫組化和RealTime PCR法檢測正常組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組中不同時間段大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bcl-2和BaX的表達,計算Bcl-2/bax比值,并用TUNEL法檢測普通高眼壓組和TGF-β1抗原干預高眼壓組RGCs凋亡并計數(shù)。
　　 三、TGF-β1對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡調(diào)控信號轉(zhuǎn)導途徑的探討
　　 采用免疫組化和RealTime PCR法檢測正常組、普通高眼壓組、TGF

10、-β1抗原干預高眼壓組中不同時間段大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Smad4和NF-κB的表達。
　　 結(jié)果：
　　 一、TGF-β1在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的表達及其抗凋亡作用
　　 TGF-β1蛋白在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗體干預高眼壓組的陽性表達率分別為33.33％、75％、4.17％。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1抗體干預高眼壓組與正常眼壓組相比,

11、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β抗體干預高眼壓組與普通高眼壓組相比,有顯著差異(P＜0.01)。
　　 TGF-β1 mRNA相對表達量在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗體干預高眼壓組分別為1.19±0.09、6.33±4.81、0.20±0.17。三組中兩兩比較,均有顯著差異(P＜0.01);
　　 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡計數(shù)在普通高眼壓組、TGF-β1抗體干預高眼壓組分別為43.58±24.30和5

12、7.47±23.25,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 TGF-β1在正常眼壓組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中有少量表達,此時,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞沒有凋亡出現(xiàn)。
　　 普通高眼壓組,在眼壓升高時,TGF-β1的表達出現(xiàn)升高,在前兩周時,表達增強顯著,兩周后TGF-β1的表達逐漸減弱,此時,隨著時間的延長,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡越來越嚴重。
　　 在TGF-β1抗體干預高眼壓組,TGF-β1的表達受到抑制,表達顯

13、著減弱,此時,隨著時間的延長,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡更加嚴重。
　　 二、TGF-β1對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bcl-2和Bax表達的影響
　　 Bcl-2蛋白在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組的陽性表達率分別為25％、58.33％、100％。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1抗原干預高眼壓組與正常眼壓組、普通高眼壓組相比,均有顯著差異(P＜0.01)

14、。
　　 Bax蛋白在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組的陽性表達率分別為20％、87.5％、33.33％。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1抗原干預高眼壓組與正常眼壓組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);TGF-β1抗原干預高眼壓組與普通高眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 Bcl-2mRNA相對表達量在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF

15、-β1抗原干預高眼壓組分別為1.54±0.34、5.00±1.85、32.09±13.38。三組中兩兩比較,均有顯著差異(P＜0.01);
　　 BaxmRNA相對表達量在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組分別為1.27±0.16、6.51±2.43、2.09±0.76。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);TGF-β1抗原干預高眼壓組與正常眼壓組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05

16、);TGF-β1抗原干預高眼壓組與普通高眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組Bcl-2/bax值分別為1.25±0.39、0.87±0.46、19.86±6.75。三組中兩兩比較,均有顯著差異(P＜0.01);
　　 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡計數(shù)在普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組分別為43.58±24.30和15.52±9.01,兩組比較,有顯

17、著差異(P＜0.01)。
　　 Bcl-2、Bax蛋白在正常眼壓組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中有少量表達,此時,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞沒有凋亡出現(xiàn)。
　　 在普通高眼壓組,當眼壓升高時,Bcl-2蛋白的表達出現(xiàn)輕度升高,兩周時達到高峰,隨后下降,而Bax蛋白的表達則是隨著時間延長而逐漸增強,Bcl-2/Bax的比值也越來越小。此時,隨著時間的延長,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡越來越嚴重。
　　 在TGF-β1抗原干預高眼壓組,Bcl-2

18、蛋白的表達顯著增強,到兩周時達到高峰,然后隨時間延長,逐漸減弱。而Bax的表達則是越來越弱,兩周后達到最低,并隨著時間延長而逐漸緩慢增強。Bcl-2/Bax的比值在TGF-β1抗原干預高眼壓組顯著增加。在TGF-βl抗原干預高眼壓組,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡明顯減輕。
　　 三、TGF-β1對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡調(diào)控信號轉(zhuǎn)導途徑的探討
　　 Smad4蛋白在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組

19、的陽性表達率分別為25％、62.5％、95.8％。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1抗原干預高眼壓組與正常眼壓組、普通高眼壓組相比,均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 NF-κB蛋白在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組的陽性表達率分別為33.33％、66.67％、100％。普通高眼壓組與正常眼壓組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1抗原干預高眼壓組與

20、正常眼壓組、普通高眼壓組相比,均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 Smad4mRNA相對表達量在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組分別為1.74±0.5、32.84±0.63、15.39±4.54。三組中兩兩比較,均有顯著差異(P＜0.01);
　　 NF-κBmRNA相對表達量在正常眼壓組、普通高眼壓組、TGF-β1抗原干預高眼壓組分別為3.70±1.19、32.37±12.01、1365.60±

21、732.22。三組中兩兩比較,均有顯著差異(P＜0.01);
　　 Smad4、NF-κB蛋白在正常眼壓組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中有少量表達。
　　 在普通高眼壓組,當眼壓升高時,Smad4、NF-κB蛋白的表達出現(xiàn)輕度升高,兩周時達到最大,隨后逐漸下降。
　　 在TGF-β1抗原干預高眼壓組,Smad4、NF-κB蛋白的表達顯著增強,到兩周時達到高峰,然后隨時間延長,逐漸減弱。
　　 在普通高眼壓組和TGF-

22、β1抗原干預高眼壓組,Smad4、NF-κB蛋白表達與Bcl-2、Bax蛋白在兩組中的表達相對一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、TGF-β1可能作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子或者抗凋亡因子可以抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。
　　 2、在高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中,Bcl-2蛋白表達相對增強,可以抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡;Bax蛋白的表達相對增強,可以促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。Bcl-2/Bax比值升高,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的