大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的興奮性及其調(diào)控.pdf

1、第一部分.大麻素受體信號(hào)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞誘發(fā)動(dòng)作電位的作用
　　內(nèi)源性大麻素受體信號(hào)系統(tǒng)參與調(diào)控多種生理過(guò)程，包括攝食、體重控制、免疫、學(xué)習(xí)與記憶、鎮(zhèn)痛、運(yùn)動(dòng)控制等。目前已發(fā)現(xiàn)的大麻素受體有兩種:CB1和CB2，CB1主要表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)，而CB2主要存在于免疫系統(tǒng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素可以作為逆向信號(hào)，通過(guò)激活突觸前的大麻素CB1受體調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。已有的研究表明，視網(wǎng)膜組織也存在有一套完整的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，但研

2、究主要集中在激活大麻素CB1受體對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元鉀通道和鈣通道的調(diào)控。盡管大麻素CB1受體在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上也有豐富的表達(dá)，但該信號(hào)系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用，尤其是對(duì)細(xì)胞興奮性的調(diào)控卻鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)我們利用膜片鉗電流鉗技術(shù)，在大鼠視網(wǎng)膜薄片上，研究了激活大麻素受體對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞誘發(fā)動(dòng)作電位的影響。
　　我們用注入電流和注入染料法來(lái)區(qū)分ON，OFF亞型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這兩類(lèi)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有明顯的區(qū)

3、別。盡管如此，我們?nèi)匀昏b定了細(xì)胞的ON和OFF亞型。我們首先研究了突觸輸入對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表現(xiàn)出規(guī)律性的自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放，在灌流液中加入突觸傳遞阻斷劑（包括興奮性的谷氨酸受體阻斷劑CNQX和D-APV，抑制性的GABAA和甘氨酸受體阻斷劑bicuculline和strychnine）后，大部分細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放逐漸減少，最后消失，說(shuō)明大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放依賴(lài)于突觸輸入。然

4、后，我們?cè)谧钄嗤挥|輸入的情況下，研究了大麻素受體激動(dòng)劑WIN55212-2對(duì)電流注入（從+10 pA到+100 pA）誘發(fā)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。結(jié)果表明，+10 pA的注入電流并不能使所有細(xì)胞都誘發(fā)出動(dòng)作電位，從+20 pA注入電流開(kāi)始，動(dòng)作電位的發(fā)放頻率逐漸增加（從5.8±1.9Hz到67.6±3.3 Hz，n=17），且放電頻率與注入電流呈線性關(guān)系，在灌流液中加入WIN55212-2(5μM)對(duì)動(dòng)作電位的發(fā)放頻率沒(méi)有顯著影響（

5、從7.3±2.5 Hz到65.5±3.3 Hz，n=17，P值均＞0.05）。同時(shí)，WIN55212-2對(duì)到達(dá)閾值所需電位、從注入電流到爆發(fā)第一個(gè)動(dòng)作電位所需時(shí)間均沒(méi)有顯著影響。然而, WIN55212-2顯著抑制單個(gè)動(dòng)作電位的最大上升速率(+dv/dt max)（對(duì)照組:185.5±16.6mV/ms到192.4±13.8 mV/ms, WIN55212-2:175.7±16.0 mV/ms到183.0±13.1mV/ms，n=17，

6、P＜0.05到0.01)，和最大下降速率(-dv/dt max)（對(duì)照組:-159.4±17.7 mV/ms到-163.5±13.0 mV/ms,WIN55212-2:-142.8±15.2 mV/ms到-149.3±11.1 mV/ms，n=17，P＜0.05到0.001）。WIN55212-2對(duì)動(dòng)作電位的作用可能與其調(diào)控參與動(dòng)作電位形成的K+和Ca2+等離子通道有關(guān)。
　　這些結(jié)果證明，激活大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的大麻素受體，可調(diào)控細(xì)

7、胞的某些離子通道，進(jìn)而影響細(xì)胞的興奮性。詳細(xì)的機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。
　　第二部分.Kir和Ih通道對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自發(fā)放電的調(diào)控作用
　　神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是視網(wǎng)膜的唯一輸出神經(jīng)元，它整合來(lái)自于雙極細(xì)胞的興奮性輸入和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的抑制性輸入，其興奮性的改變直接影響視網(wǎng)膜的視覺(jué)信息輸出。內(nèi)向整流鉀通道(Kir)和超極化激活陽(yáng)離子通道(Ih)與細(xì)胞的興奮性密切相關(guān)，但它們?cè)诖笫笠暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的表達(dá)、作用和調(diào)控機(jī)制尚存爭(zhēng)議。

8、r>　　本研究利用電生理技術(shù)，在離體視網(wǎng)膜薄片上，通過(guò)研究Kir和Ih通道對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自發(fā)放電的影響，分析Kir和Ih在維持神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮性中的作用。
　　主要結(jié)果如下:(1)對(duì)于大部分的細(xì)胞，無(wú)論是ON型還是OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其自發(fā)動(dòng)作電位均依賴(lài)于突觸輸入，有一小部分的細(xì)胞阻斷突觸輸入后放電依然存在且頻率顯著增強(qiáng)，這部分細(xì)胞可能是ipRGCs。興奮性突觸輸入增加自發(fā)放電頻率，減小脈沖間間隔，且使得放電模式變得更不規(guī)則。抑制性突

9、觸輸入減少大部分細(xì)胞的自發(fā)放電頻率，但有26％(6/23)的細(xì)胞自發(fā)放電頻率增加且脈沖間間隔減小;(2)無(wú)論是ON型還是OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，阻斷Kir通道又能重新誘導(dǎo)出放電，脈沖間間隔減小，脈沖發(fā)放模式不變;(3)無(wú)論是ON型還是OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，用非特異性阻斷劑Cs+阻斷Ih后均顯著提高自發(fā)放電頻率，且膜電位略有升高，脈沖間間隔無(wú)顯著變化，脈沖發(fā)放更不規(guī)則。用特異性阻斷劑ZD7288阻斷Ih后，細(xì)胞膜電位顯著降低，其中有71％(10