局部高溫誘導的大鼠生精細胞凋亡及其機制的研究.pdf

1、[目的]
　　 研究睪丸局部熱作用后生精細胞的凋亡情況；探索各類生精細胞對熱的敏感性，對熱作用引起生精障礙作更深入研究；研究MPTP的開放與熱誘導的生精細胞凋亡之間的關(guān)系；研究熱作用后HSP70、Bax、Bcl-2、和Caspase-3蛋白在生精細胞的表達情況，在分子水平上探討熱作用誘導生精細胞凋亡的機制。
　　 [方法]
　　 雄性Sprague-Dawlcy(SD)大鼠40只，隨機分為3組：正常對照組、熱應激

2、組(HS組)、CsA組(HS+CsA)。CsA組大鼠熱應激前按照10mg/(kg.d)劑量，將環(huán)孢素A(Cyclosporine A，CsA)溶于生理鹽水灌胃，每天一次，連續(xù)4d；HS組及正常對照組給予等量生理鹽水灌胃。熱應激組和CsA組均按熱處理后6h和24h隨機分成2個亞組(n=8)。熱應激組和CsA組大鼠陰囊浸于43℃恒溫水浴中40min，對照組浸于22℃水浴中40min。HS組和CsA組分別在處理后6h和24h采取標本，對照組在

3、處理后24h采取標本。應用HE染色檢測睪丸組織形態(tài)學改變；采用DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞儀檢測和原位末端標記法(TdT-mediateddUDP nick end labeling，TUNEL)檢測睪丸局部受熱后生精細胞凋亡情況；應用免疫組化法測定HSP70、Bax、Bcl-2、和Caspase-3在熱作用后生精細胞的表達情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.組織學觀察大鼠睪丸局部受熱后，睪丸組織生精上皮變薄，生精細胞排

4、列紊亂，數(shù)量減少.24h組較6h組損害更為嚴重，多數(shù)管腔內(nèi)可見多核巨細胞。
　　 2.生精細胞凋亡情況(1)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測：HS(24)組和CsA(24)組均出現(xiàn)了典型的DNA梯狀條帶，其中HS(24h)組條帶最明顯。
　　 (2)流式細胞儀檢測：熱作用后各組均有亞單倍體細胞百分率明顯增高(P<0.01)，HS(24h)組增高最明顯。對各類生精細胞DNA含量進行分析表明，熱處理后24h時1C、4C細胞百分比均明

5、顯低于對照組(P<0.01)，其中HS組較CsA組降低更明顯。
　　 (3)TUNEL法檢測：在熱作用后24h時對凋亡指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：除CsA組的Ⅱ-Ⅵ期外，HS組及CsA組的其它群的凋亡指數(shù)與對照組相比均明顯增高(P<0.01)。熱應激后在早期的(Ⅰ)和晚期的(Ⅻ-ⅩⅣ)凋亡發(fā)生最多，其次是中期(Ⅶ-Ⅷ)和晚期的(Ⅸ-Ⅺ)，早期的(Ⅱ-Ⅵ)凋亡細胞最少。Ⅰ期TUNEL陽性細胞主要定位在圓形精子細胞，其它各期主要定位在粗線期精母細

6、胞。HS組與CsA組相比，在Ⅰ期、Ⅱ-Ⅵ期、Ⅶ-Ⅷ期和Ⅸ-Ⅺ期的生精小管內(nèi)CsA組的凋亡指數(shù)均明顯低于HS組(P<0.01)，在Ⅻ-ⅩⅣ期的生精小管CsA組的凋亡指數(shù)也低于HS組但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.睪丸組織HSP70、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達情況對組織切片進行免疫組織化學染色結(jié)果顯示：熱處理后Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達均明顯增高，且與TUNEL法檢測的凋亡細胞類型

7、及其所處的生精周期基本一致。熱處理后HSP70蛋白的表達水平隨著時間的延長逐漸下降。
　　 [結(jié)論]
　　 1、熱作用引起大鼠睪丸生精上皮的損傷，導致生精障礙，熱作用后生精細胞凋亡增加是這種生精障礙的機制之一。
　　 2、熱作用對生精細胞的損傷具有明顯的階段和細胞特異性.
　　 3、抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開