Anxa5表達上調增強鼠肝癌Hca-P淋巴道轉移潛能.pdf

1、背景:淋巴道轉移是影響惡性腫瘤患者預后和生存的主要因素，腫瘤淋巴道轉移機制的研究可為其臨床診斷和治療提供依據(jù)。Anxa5(Annexin A5，膜聯(lián)蛋白A5)是膜聯(lián)蛋白家族一員。Anxa5表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移及耐藥性等密切相關。但Anxa5與腫瘤淋巴道轉移關系的研究鮮有報道。本課題組前期采用基因芯片高通量篩選和蛋白質組學等技術對來源于同一鼠肝癌細胞克隆、遺傳背景相同但淋巴道轉移潛能顯著不同的亞克隆細胞系Hca-F（淋巴結轉

2、移率約75％）和Hca-P（淋巴結轉移率約25％）的研究表明，Anxa5在Hca-F中的表達是其在Hca-P中的3.16倍，提示Anxa5可能是潛在促進鼠肝癌淋巴道轉移的蛋白。
　　目的:1.檢測Anxa5在Hca-P和Hca-F中的差異表達;2.構建pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5真核表達質粒，并轉染至Hca-P，篩選獲得Anxa5表達穩(wěn)定上調的Hca-P單克隆細胞株;3.觀察上調Anxa5后Hca-P細胞形態(tài)及亞顯

3、微結構的變化;4.探究Anxa5表達上調對Hca-P體外增殖、遷移、侵襲及體內成瘤性及淋巴結轉移能力的影響，為進一步研究淋巴道轉移機制提供新線索。
　　方法:1.Western blot檢測Anxa5在Hca-P和Hca-F中的表達;2.RT-PCR方法擴增小鼠全長Anxa5編碼序列，并將構建的pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表達質粒轉染至Hca-P，G418篩選及有限稀釋法獲得單克隆細胞株，同時建立穩(wěn)定轉染pcDNA

4、3.1-V5/HisB空質粒的Hca-P細胞株作為對照，Western blot檢測Anxa5表達穩(wěn)定上調的單克隆細胞株;3.倒置光學顯微鏡觀察Anxa5表達上調后Hca-P細胞形態(tài)的變化，透射電子顯微鏡觀察上調Anxa5后Hca-P細胞亞顯微結構的變化;4.CCK-8法檢測上調Anxa5后Hca-P增殖能力變化，Transwell法檢測Anxa5表達上調對Hca-P體外遷移和侵襲能力的影響，通過小鼠足墊皮下注射分析Anxa5表達量變化

5、致Hca-P體內成瘤及淋巴結轉移情況。
　　結果:1.Anxa5在Hca-F中的表達量是其在Hca-P中的～2.55倍;2.酶切及測序結果顯示，pMD(@)19-T-Anxa5克隆質粒和pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表達質粒構建成功;3.Anxa5上調導致細胞體積增大，細胞內粗面內質網(wǎng)和線粒體數(shù)量增加，線粒體腫脹，線粒體內嵴減少，基質密度降低;4.篩選獲得Anxa5表達穩(wěn)定上調的單克隆細胞株Anxa5-Hca-P-1

6、、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3，與Control-Hca-P相比，Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3中Anxa5蛋白水平分別上調了15.0％、20.3％和67.7％;5.Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2相對于Control-Hca-P增殖明顯加快，Anxa5-Hca-P-3與Control-Hca-P相比增殖減慢;6.Anxa5-Hca-P-

7、1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3相比于Control-Hca-P的遷移能力分別提高了68.11％、60.15％和167.39％;7.與Control-Hca-P相比，Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3的侵襲能力分別提高了47.18％、57.57％和100.03％;8.Anxa5表達上調后各組間腫瘤大小無差異，但能促進腫瘤表觀惡性程度;9.Anxa5-Hca-P-1

8、組和Anxa5-Hca-P-3組淋巴結轉移程度明顯高于Control-Hca-P組，Anxa5-Hca-P-3組淋巴結轉移程度明顯高于Anxa5-Hca-P-1組。
　　結論:1.Anxa5在鼠肝癌淋巴道轉移細胞株Hca-P和Hca-F中均有表達，且在Hca-P中表達低于Hca-F;2.Anxa5表達上調導致細胞體積增大，細胞內粗面內質網(wǎng)和線粒體數(shù)量增加，線粒體腫脹，線粒體內嵴減少，基質密度降低;3.Anxa5表達上調促進Hca-