shRNA抑制小鼠肝癌細胞株JNK表達及與淋巴道轉移關系的研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的根本特征是其轉移潛能。轉移是導致惡性腫瘤患者死亡率高、預后差的根本原因，目前其發(fā)生機制尚不清楚，已成為當今研究的重要課題。對于上皮來源的惡性腫瘤，其早期轉移的主要方式是淋巴道轉移，是影響患者預后的重要因素。因此，對于淋巴道轉移機制進行研究，并在此基礎上建立起相應的干預手段，將對惡性腫瘤患者具有重要的現(xiàn)實意義。原發(fā)性肝細胞癌（primary hepatocellular carcinoma）是常見的惡性腫瘤之

2、一，在我國具有較高的發(fā)病率。盡管進行了大量的研究與探討，但是肝癌轉移的分子基礎和機制尚不清楚。 Hca-F和Hca-P是一對來源于同一親本細胞，而且淋巴道轉移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水型細胞株。其中Hca-F是具有高轉移潛能的細胞株，淋巴結轉移率高于70%，Hca-P是低轉移潛能的細胞株，淋巴結轉移率低于30%。這為研究淋巴道轉移機制提供了較為理想的細胞模型。 本實驗組前期致力于小鼠肝癌淋巴道轉移機制的研究。在對Hca

3、-F細胞和Hca-P細胞的一系列研究中，利用抑制性消減雜交技術及高通量基因芯片技術篩選出了在Hca-F細胞和Hca-P細胞的差異表達基因；并采用定量蛋白質組學技術建立了高低淋巴道轉移力小鼠肝癌細胞熒光差異蛋白表達圖譜。其中在基因水平上，JNK在Hca-F細胞中的表達顯著高于Hca-P細胞，提示JNK可能與小鼠肝癌的淋巴道轉移潛能相關。由于在人類組織細胞中具有JNK同源蛋白，因此，研究小鼠肝癌細胞株JNK與淋巴道轉移的關系，對人類肝癌淋巴

4、道轉移的的防治具有重要意義。 c-Jun N端激酶（JNK）是一種能夠特異性磷酸化c-Jun的蛋白激酶，位于重要的細胞信號傳導通路-粘著斑（focal adhesion）通路上，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的主要成員之一。MAPK是廣泛存在于哺乳動物細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對于調節(jié)蛋白質的功能起著非常重要的作用，其本身及其介導的信號轉導通路與腫瘤有著密切的關系。JNK對于細胞發(fā)育，形態(tài)形成和分化是必需的。J

5、NK信號通路參與了多種生理過程，同時近來的研究表明JNK信號途徑也參與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，使JNK在臨床上可做為一個潛在的分子治療靶點。本研究以JNK為研究對象，探索其在Hca-F細胞株淋巴道轉移過程中的作用。經(jīng)檢索，目前國內外尚無JNK與肝癌淋巴道轉移關系的研究報道。 目的： 1．從蛋白質水平上比較JNK在淋巴道轉移潛能不同小鼠肝癌細胞系中的表達，為進一步研究肝癌淋巴道轉移的機制奠定基礎。 2．構建p

6、Silencer-shRNA表達載體，穩(wěn)定轉染Hca-F細胞獲得JNK的表達水平顯著下調的Hca-F細胞株。 3．研究JNK表達水平的下降對小鼠肝癌細胞株Hca-F在細胞增殖、細胞遷移和侵襲能力等方面的影響，由此確定JNK表達水平與小鼠肝癌細胞淋巴道轉移潛能間的關系。 方法： 1．采用蛋白免疫印跡方法檢測磷酸化JNK（p-JNK）在Hca-F、Hca-P細胞株中表達有無差異。 2．由上海之江生物公司依據(jù)G

7、ene Bank中小鼠JNK基因序列（序列登錄號：NM_016700．3）設計shRNA靶序列，合成3條shRNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3，同時設計shRNA-無關序列。獲取pSilencerTM3．1-H1neo質粒，然后對質粒進行雙酶切，shRNA合成序列退火，T4 DNA ligase連接質粒與三條shRNA的DNA模板和無關序列的退火后產物，連接產物分別命名為 pSilen

8、cer-shRNA-1、 pSilencer-shRNA-2、 pSilencer-shRNA-3、pSilencer-shRNA-無關序列。pSilencer-shRNA質粒抽提獲得表達載體，對三條pSilencer-shRNA表達載體經(jīng)測序鑒定（引物為5'-GTTTTCCCA GTCACGAC-3'），結果與設計的三條shRNA靶序列和Gene Bank中序列比對。確定序列無誤后，將三條pSilencer-shRNA表達載體和無關序

9、列分別以脂質體法穩(wěn)定轉染Hca-F細胞，用含400ug/mlG418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得pSilencer-shRNA表達載體穩(wěn)定轉染的Hca-F細胞和無關序列對照組細胞。在mRNA和蛋白質水平檢測三條shRNA對JNK的表達的抑制作用，同時設RNAi陰性對照組（穩(wěn)定轉染pSilencer-shRNA-無關序列的Hca-F細胞株）以及陽性對照組（正常的Hca-F細胞株），以篩選出RNAi效果最好的shRNA，用于后續(xù)實驗。 3

10、．以三組細胞（分別為Hca-F細胞株、穩(wěn)定轉染pSilencer-shRNA-無關序列的Hca-F細胞株、經(jīng)篩選的穩(wěn)定轉染pSilencer-shRNA表達載體的Hca-F細胞株）為實驗對象。以CCK-8法檢測三組細胞的細胞活力和分裂增殖能力；Transwell實驗檢測pSilencer-shRNA轉染Hca-F細胞后對細胞遷移能力和侵襲能力的影響。 結果： 1．p-JNK在小鼠腹水型肝癌細胞系Hca-F和Hca-P均有

11、表達，在Hca-F細胞株中的表達顯著高于Hca-P，二者間有顯著性差異。 2．成功構建pSilencer-shRNA表達載體并穩(wěn)定轉染Hca-F細胞，3個表達載體中所含3條shRNA序列被正確檢測出，靶序列與GenBank中序列一致。經(jīng)篩選pSilencer-shRNA-2對JNK表達抑制的效果最好，轉染后細胞株中JNK在mRNA和蛋白質水平的表達遠低于其他2組及無關序列組和Hca-F細胞組，pSilencer-shRNA-2被

12、選擇作為后續(xù)實驗的JNK穩(wěn)定下調的細胞株。 3．CCK-8實驗結果表明JNK有促進細胞增殖的作用：體外遷移實驗結果表明，JNK下調組的穿膜細胞數(shù)明顯低于陽性和陰性對照組；體外侵襲實驗結果表明，JNK下調組穿過人工基底膜的細胞數(shù)明顯低于陽性和陰性對照組。說明在Hca-F中下調JNK表達之后，其遷移能力、侵襲能力均顯著下降。 結論： 1．p-JNK在小鼠腹水型肝癌細胞系Hca-F和Hca-P均有表達，在Hca-F細胞

13、株中的表達顯著高于Hca-P，二者間有顯著性差異。 2．利用pSilencerTM3．1-H1 neo質粒和shRNA成功構建了三個pSilencer-shRNA表達載體，并穩(wěn)定轉染Hca-F細胞株，獲得JNK表達穩(wěn)定下調的Hca-F細胞株，經(jīng)過篩選pSilencer-shRNA-2對Hca-F細胞中JNK抑制效果最明顯，可作為后續(xù)研究的細胞株，為通過下調JNK在Hca-F的表達以研究JNK與肝癌淋巴道轉移的關系打下了基礎。