PRRSVGP2a蛋白的T、B細(xì)胞表位鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，可感染不同年齡、品系的豬，以感染懷孕母豬、仔豬為主，它的主要癥狀為發(fā)熱、厭食，妊娠母豬早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等，給世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。P

2、RRSV的最大特點(diǎn)是能夠引起免疫抑制和繼發(fā)性感染，而目前的PRRSV疫苗對(duì)PRRSV防控不甚理想，所以 PRRSV一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病源之一。而前人的研究結(jié)果表明，細(xì)胞免疫在PRRSV免疫保護(hù)中起重要作用，因此篩選PRRSV的T細(xì)胞表位和開發(fā)基于該表位的PRRSV新型疫苗對(duì)PRRSV的防控具有重大意義。前期的研究表明PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白（GP）2a能激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在篩選GP2a的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位

3、，為PRRSV的防控打下基礎(chǔ)。
　　本文首先通過生物信息學(xué)的方法對(duì)GP2a的T、B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后通過重疊多肽法進(jìn)行鑒定。提取PRRSV BJ-4毒株的總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增GP2a基因，并將其連接于pMD19-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T-GP2a。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件SYFPEITHI、RANKPEP、IEDB預(yù)測(cè)CD8+T細(xì)胞表位，運(yùn)用Propped預(yù)測(cè)與MHC-II分子相

4、結(jié)合的CD4+T細(xì)胞表位，運(yùn)用DNAstar軟件、ABCpred、Bepipred1.0預(yù)測(cè)GP2a的B細(xì)胞表位。其中CD8+T細(xì)胞表位最可能存在于51~59、56~64、78~86、105~113、143~151、173~181、182~190、198~206、202~210位氨基酸；MHC-Ⅱ結(jié)合的表位肽有9個(gè)，氨基酸區(qū)域分別為75~83、89~97、116~124、144~152、172~180、181~189、183~191、1

5、91~199、211~220；運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位區(qū)為41~47、51~66、86~93、104~119、122~126、150~165、195~208。
　　由預(yù)測(cè)的表位氨基酸位置推測(cè)，GP2a的T、B細(xì)胞表位主要在GP2a的胞外區(qū)。以pCDNA3.1-GP2a為模板，使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)出一對(duì)針對(duì)GP2a胞外區(qū)的特異性引物，通過 PCR等方法，將目的基因連接到原核表達(dá)載體pET-32a(pET-

6、32a-GP2a41~208aa)上，1 mmol/L丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)鑒定GP2a胞外區(qū)蛋白以包涵體形式表達(dá)，分子量約為36 kDa。同時(shí)，對(duì)包涵體變性與復(fù)性，將復(fù)性后蛋白以50μg/只的劑量免疫 Balb/C小鼠，經(jīng)三次免疫后效價(jià)可達(dá)到1:102400，該結(jié)果顯示GP2a的胞外區(qū)具有良好的免疫原性。
　　合成重疊9個(gè)氨基酸、總長為18氨基酸的重疊多肽，將重疊肽按照

7、十字交叉法分成9個(gè)肽庫，以這些肽庫為包被抗原，將第四次免疫后小鼠血清作為一抗，經(jīng)ELISA方法鑒定出GP2a的B細(xì)胞表位為第18號(hào)肽，且當(dāng)血清稀釋度為1:6400時(shí)，陽性血清反應(yīng)值與陰性反應(yīng)值之比仍大于2.1，同時(shí)通過逐步縮短18號(hào)肽的長度（每次減去羧基端與氨基端各1個(gè)氨基酸），經(jīng)ELISA確定表位的核心區(qū)為PTPGSRPKLHDFQ。
　　將終濃度為20μg/mL肽庫或單肽體外刺激第四次免疫后小鼠的脾淋巴細(xì)胞18小時(shí)，然后收集細(xì)