PRRSVGP2a蛋白的T、B細胞表位鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，可感染不同年齡、品系的豬，以感染懷孕母豬、仔豬為主，它的主要癥狀為發(fā)熱、厭食，妊娠母豬早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等，給世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。P

2、RRSV的最大特點是能夠引起免疫抑制和繼發(fā)性感染，而目前的PRRSV疫苗對PRRSV防控不甚理想，所以 PRRSV一直是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病源之一。而前人的研究結(jié)果表明，細胞免疫在PRRSV免疫保護中起重要作用，因此篩選PRRSV的T細胞表位和開發(fā)基于該表位的PRRSV新型疫苗對PRRSV的防控具有重大意義。前期的研究表明PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白（GP）2a能激發(fā)機體的細胞免疫和體液免疫，因此，本實驗旨在篩選GP2a的T細胞表位和B細胞表位

3、，為PRRSV的防控打下基礎。
　　本文首先通過生物信息學的方法對GP2a的T、B細胞表位進行預測，然后通過重疊多肽法進行鑒定。提取PRRSV BJ-4毒株的總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴增GP2a基因，并將其連接于pMD19-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T-GP2a。運用生物信息學軟件SYFPEITHI、RANKPEP、IEDB預測CD8+T細胞表位，運用Propped預測與MHC-II分子相

4、結(jié)合的CD4+T細胞表位，運用DNAstar軟件、ABCpred、Bepipred1.0預測GP2a的B細胞表位。其中CD8+T細胞表位最可能存在于51~59、56~64、78~86、105~113、143~151、173~181、182~190、198~206、202~210位氨基酸；MHC-Ⅱ結(jié)合的表位肽有9個，氨基酸區(qū)域分別為75~83、89~97、116~124、144~152、172~180、181~189、183~191、1

5、91~199、211~220；運用生物信息學預測的B細胞表位區(qū)為41~47、51~66、86~93、104~119、122~126、150~165、195~208。
　　由預測的表位氨基酸位置推測，GP2a的T、B細胞表位主要在GP2a的胞外區(qū)。以pCDNA3.1-GP2a為模板，使用Primer Premier5.0設計出一對針對GP2a胞外區(qū)的特異性引物，通過 PCR等方法，將目的基因連接到原核表達載體pET-32a(pET-

6、32a-GP2a41~208aa)上，1 mmol/L丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)鑒定GP2a胞外區(qū)蛋白以包涵體形式表達，分子量約為36 kDa。同時，對包涵體變性與復性，將復性后蛋白以50μg/只的劑量免疫 Balb/C小鼠，經(jīng)三次免疫后效價可達到1:102400，該結(jié)果顯示GP2a的胞外區(qū)具有良好的免疫原性。
　　合成重疊9個氨基酸、總長為18氨基酸的重疊多肽，將重疊肽按照

7、十字交叉法分成9個肽庫，以這些肽庫為包被抗原，將第四次免疫后小鼠血清作為一抗，經(jīng)ELISA方法鑒定出GP2a的B細胞表位為第18號肽，且當血清稀釋度為1:6400時，陽性血清反應值與陰性反應值之比仍大于2.1，同時通過逐步縮短18號肽的長度（每次減去羧基端與氨基端各1個氨基酸），經(jīng)ELISA確定表位的核心區(qū)為PTPGSRPKLHDFQ。
　　將終濃度為20μg/mL肽庫或單肽體外刺激第四次免疫后小鼠的脾淋巴細胞18小時，然后收集細