PRRSVGP5蛋白抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建表達(dá)與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一種急性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。前期研究發(fā)現(xiàn)感染了PRRSV的豬血清中有兩種不同的抗GP5的自身抗獨(dú)特型抗體（auto-Ab2），在針對PRRSV感染的免疫網(wǎng)絡(luò)中能起到正向或負(fù)向調(diào)控作用。前期制備的針對抗PRRSV GP5抗體的單克隆抗獨(dú)特型抗體（Mab2-5G2）具有結(jié)合Marc-145細(xì)胞的功能。單鏈抗體具有免疫原性小，仍保持親本抗體結(jié)合抗原的特異親和力；而且

2、分子量小，實(shí)質(zhì)組織穿透力強(qiáng)，血漿半衰期短，因此，單鏈抗體在臨床疾病的研究、診斷和治療方面具有重要的應(yīng)用價值。為了進(jìn)一步明確Mab2-5G2結(jié)合細(xì)胞的功能區(qū)域，需要制備只包含抗體可變區(qū)片段（Fv）的Mab2-5G2單鏈抗體（scFv）。本研究從分泌Mab2-5G2的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因；根據(jù)鼠源抗體基因家族可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序

3、列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了抗體重、輕鏈可變區(qū)基因的引物；以cDNA為模板擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因。以VH-linker-VL的形式通過重疊PCR（overlapping-PCR）擴(kuò)增出scFv基因，基因序列分析表明：VH和VL通過編碼(G4S)3連接肽的45bp基因序列連接在一起構(gòu)成scFv基因，其全長762bp,VH基因位于linker的上游，長360bp，編碼120個氨基酸；VL基因位于linker的下游，長357

4、bp，編碼119個氨基酸。將scFv與原核表達(dá)載體pEasy-E1連接構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pEasy-scFv。將pEasy-scFv轉(zhuǎn)化受體菌 E.Coli1.BL21（Rosetta）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。表達(dá)后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，其分子量大約為30KD，與預(yù)期大小一致。Ni-resin純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用鼠源抗His的單

5、抗和兔源抗體Ab3為一抗（經(jīng)純化的針對Mab2-5G2可變區(qū)的抗體）進(jìn)行Western-blot分析鑒定，結(jié)果表明scFv蛋白具有良好的免疫原性。純化后的ScFv蛋白用尿素梯度為8mol/L～2 mol/L且PH梯度為6～8.5的復(fù)性溶液在16℃條件下進(jìn)行雙梯度透析復(fù)性，每個梯度透析12h；復(fù)性后的scFv蛋白能夠具有天然抗體Mab2-5G2的功能可特異性結(jié)合Marc-145細(xì)胞。分別用Mab2-5G2、scFv免疫新西蘭白兔制備抗血清