ROCK抑制劑—法舒地爾對大鼠脊髓損傷修復(fù)作用的實驗研究.pdf

1、目的:本實驗的目的是觀察Rho激酶抑制劑-法舒地爾和RNAi介導(dǎo)的RhoA基因沉默對大鼠脊髓損傷的修復(fù)作用及其對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞和雪旺細胞增殖的影響。為臨床治療脊髓損傷提供實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:體外實驗:體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞,雪旺細胞根據(jù)處理因素不同分各為六組(每組設(shè)六個副孔):A為空白對照組,B加5μmol/L法蘇地爾,C加10μmol/L法蘇地爾,D加15μmol/L法蘇地爾,E加20μmol/L法蘇地爾,

2、F經(jīng)siRNA沉默RhoA基因組。相應(yīng)處理后第3天,用RT-PCR,Western blot檢測各組神經(jīng)干細胞RhoA基因和蛋白的表達。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法觀察細胞增殖情況；采用流式細胞術(shù)測定細胞周期分布的變化。連續(xù)5天用細胞計數(shù)法測定生長曲線。體內(nèi)實驗:雌性SD大鼠60只,體重200-250g,以半切法制成脊髓半橫斷模型。隨機分成3組A組為單純損傷組,B組為法舒地爾治療組,C組RhoA基因沉默治療組。于傷后1w、2w、4

3、w、6w、8w進行BBB評分和斜板實驗等運動功能檢測。第4周取材行病理切片HE染色RT-PCR,Western blot檢測各組脊髓組織RhoA基因和蛋白的表達。8周后取材,行辣根過氧化物酶示蹤觀察(HRP)及通過體感誘發(fā)電位觀察神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果體外實驗結(jié)果:給予相應(yīng)處理3天后神經(jīng)干細胞D,E,F組與A,B,C組相比RhoA基因和蛋白表達量明顯降低,細胞的生長速度明顯增快,細胞周期G0/G1期減少,S期細胞數(shù)增多

4、。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。E組與F組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。處理3天后雪旺細胞D,E,F組與A,B,C組相比RhoA基因和蛋白表達量明顯降低,細胞的生長速度明顯增快,細胞周期G0/G1期減少,S期細胞數(shù)增多。各組間異差異有統(tǒng)計學(xué)意義。E組與F組相比RhoA基因和蛋白表達量有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。體內(nèi)實驗結(jié)果:傷后4周B、C兩組大鼠后肢運動功能均有較明顯恢復(fù),C組較B組為快,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A組亦有所恢復(fù),但程度較輕。病理觀察A組未見神經(jīng)軸

5、索通過,B組和C組可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)。B,C組與A相比RhoA基因和蛋白表達水平明顯降低,B組較C組降低的更明顯。HRP陽性神經(jīng)纖維數(shù)B,C組較A組多。B組略多于C組。B,C組大鼠體感誘發(fā)電位的潛伏期、波幅優(yōu)于A組,B組略優(yōu)于C組。
　　 結(jié)論:Rho激酶抑制劑法舒地爾和RNAi介導(dǎo)的RhoA基因沉默的研究表明:在體外實驗均能促進神經(jīng)干細胞/雪旺細胞的增殖。但是,神經(jīng)干細胞組給予法舒地爾最佳濃度處理和RNA干擾處理沒有統(tǒng)計學(xué)