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文檔簡介
1、腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor—α,TNF—α)是一種主要由單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生的、具有廣泛生物學活性的細胞因子。在類風濕關節(jié)炎,腸炎和感染性休克等疾病的發(fā)生、發(fā)展中占有很重要的地位。TNF—α主要通過與其位于細胞膜上的Ⅰ型受體(TNF—R1)的細胞外區(qū)域結(jié)合之后,來啟動其信號通路。TNF—R1的細胞外區(qū)域包含四個亞功能域,分別是CRD1(residues15-53),CRD2(residues54-97),CR
2、D3(residues98-138)和CRD4(residues139-166)。其中CRD1,CRD2和CRD3分別由一個A1型模塊和一個B2型模塊構(gòu)成,CRD4不同于其他三個亞功能域,它是由一個A1模塊(residues139-150)和一個結(jié)構(gòu)不規(guī)則的C2模塊(residues153-172)構(gòu)成。顯然對于各個亞功能域來說,A1模塊是相對保守的結(jié)構(gòu),極有可能在TNF—α和TNF—R1的結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用,但目前國內(nèi)外對于CRD
3、4的A1模塊在TNF—R1與TNF—α相互識別的過程中所起到的作用鮮有報道。 本研究旨在針對于TNF—R1的CRD4區(qū)域A1模塊設計衍生小肽,檢測其對于TNF—α和TNF—R1的結(jié)合的影響,對篩選出的優(yōu)選肽已申請了專利保護(在后面的內(nèi)容中將有所體現(xiàn)),并且在細胞水平和整體水平進行系統(tǒng)評價篩選出的優(yōu)選肽對于TNF—α致炎活性的抑制作用。我們的研究首次確證了TNF—R1的CRD4區(qū)域在TNF—R1與TNF—α相互識別的過程中發(fā)揮了重
4、要作用。為進一步客觀認識TNF—α和TNF—R1的結(jié)合模式,以及合理設計和開發(fā)TNF—α抑制劑提供重要的理論依據(jù)。 第1章TNF—R1的CRD4區(qū)衍生多肽的設計合成及初步活性篩選 目的:Ⅰ型TNF受體TNF—R1介導了TNF—α包括致炎作用在內(nèi)的大部分生物學效應。然而目前人們對于TNF—R1的胞外區(qū)第4功能域CRD4在TNF—α與TNF—R1的相互作用過程中的作用尚不清楚。我們以CRD4的A1模塊親水段序列為模板設計短肽
5、片段,觀察合成的短肽對于TNF—α與受體TNF—R1結(jié)合的影響從而確證CRD4在TNF—α與TNF—R1的相互作用過程中的作用。 方法: 1.以TNF—R1胞外第4區(qū)域的A1模塊疏水區(qū)為模板的天然結(jié)構(gòu)為模板,采用Fmoc法多肽固相合成技術。 2.高效液相色譜分析法,及ESI—MS質(zhì)譜分析法確定它們的純度和分子量。 3.采用生物活性酶聯(lián)免疫吸附測定法(BioLISA)觀察所合成的肽段對于TNF—α與其受體T
6、NF—R1結(jié)合情況的影響。 結(jié)果: 1.采用固相合成方法TNF—R1以胞外第4區(qū)域的A1模塊疏水區(qū)氨基酸為模板,設計合成了四條多肽序列,分別是Pep1(NH2-Arg—Gly—Phe—Phe—Leu—Arg—Glu—Asn—COOH),Pep2(NH2-Phe—Phe—Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—COOH),Pep3(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—COOH),
7、以及Pep4(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—Cys—Ser—Asn—COOH)。 2.BioLISA測試結(jié)果顯示短肽Pep3和Pep4在濃度分別為20,40,60,80,100,120μM可劑量依賴性抑制TNF—α與其受體TNF—R1的結(jié)合;然而肽段Pep1和Pep2在濃度20,40,60,80,100,120μM時均未表現(xiàn)明顯的抑制效果。 結(jié)論: TNF—R1的CRD4
8、的A1模塊衍生小肽Pep3(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—COOH)和Pep4(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—Cys—Ser—Asn—COOH)都能夠有效抑制TNF—α與其受體TNF—R1結(jié)合。雖然Pep3與Pep4的一級序列相差3個氨基酸殘基(Cys153,Ser154,Asn155),但二者對于TNF—α與其受體TNF—R1結(jié)合的抑制能力沒有明顯差異
9、。說明TNF—R1的CRD4的A1模塊區(qū)域內(nèi)能夠影響TNF—α與其受體TNF—R1結(jié)合的關鍵作用區(qū)域位于Leu145至Ser152之間。 第2章優(yōu)選多肽對于TNF-α激活的HeLa細胞中NF-κB通路的影響 目的:研究優(yōu)選多肽Pep3在體外培養(yǎng)的HeLa細胞中對于TNF—α激活的NF—κB通路的影響。 方法: 1.摸索TNF—α刺激HeLa細胞引起IκB—α降解和NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位的量效和時效關系
10、,建立TNF—α激活NF—κB通路的細胞模型。 2.利用MTT法探索HeLa細胞使用Pep3的安全劑量范圍。 3.采用Westernblot、核蛋白提取等方法探討Pep3對于TNF—α刺激HeLa細胞引起IκB—α降解和NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位的影響。 結(jié)果: 1.與正常組相比,TNF—α(0.6-2.0ng/ml)作用于HeLa細胞(5-40min)能夠顯著誘導IκB—α降解,并呈一定的時效與量效關系
11、,其中誘導IκB—α降解的最適條件是1.0ng/mlTNF—α刺激30min。 2.與正常組相比,TNF—α(0.5-8.0ng/ml)作用于HeLa細胞(5-40min)能夠顯著誘導NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位,并呈一定的時效與量效關系,其中誘導NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位的最適條件是2.0ng/mlTNF—α刺激30min。 3.Pep3(2.5μM-150μM對于HeLa細胞的細胞活力沒有影響(p>0.05vs.對照組
12、)。 4.Pep3(2.5μM,5μMand10μM)與TNF—α預孵育1h后,能夠顯著抑制TNF—α引起的IκB—α降解,并呈顯著的劑量依賴關系。 5.Pep3(10μMand20μM)與TNF—α預孵育1h后,能夠顯著抑制TNF—α引起的NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位,并呈顯著的劑量依賴關系。 結(jié)論:在HeLa細胞上成功建立TNF—α激活NF—κB通路的細胞模型。Pep3主要通過抑制TNF—α與其細胞膜上受體的結(jié)
13、合,從而濃度依賴性地抑制抑制TNF—α刺激HeLa細胞起的IκB—α降解和NF—κBp65亞基核轉(zhuǎn)位。 第3章優(yōu)選多肽Pep3對LPS誘導RAW264.7細胞釋放炎癥因子的影響 目的:評價優(yōu)選肽Pep3對細菌脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7細胞釋放炎癥因子的影響。 方法: 1.體外培養(yǎng)小鼠RAW264.7細胞,LPS刺激小鼠RAW264.7細胞分泌TNF—α和IL—6。 2.利用MTT法探
14、索HeLa細胞使用Pep3的安全劑量范圍。 3.ELISA法檢測不同濃度Pep3對于LPS刺激小鼠RAW264.7細胞釋放TNF—α和IL—6的影響。 結(jié)果: 1.與正常組相比,LPS(100ng/ml)刺激小鼠RAW264.7細胞(30min—6h)所分泌的TNF—α和IL—6均時間依賴性地增加。 2.本實驗中涉及的Pep3的濃度(2.5μM—50μM)對于小鼠RAW264.7細胞的細胞活力沒有影響(p
15、>0.05vs.對照組),均為適用于小鼠RAW264.7細胞的安全濃度。 3.Pep3(10μM,20μMand40μM)可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7細胞釋放TNF—α和IL—6,并呈一定的劑量依賴關系。 結(jié)論:成功建立LPS刺激小鼠RAW264.7細胞釋放炎癥因子的細胞模型。Pep3主要通過抑制細胞上清中TNF—α的活性,從而濃度依賴性地抑制抑制LPS刺激小鼠RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6。
16、 第4章優(yōu)選肽Pep3對GalN/LPS致小鼠急性肝損傷的保護作用 目的:體內(nèi)評價優(yōu)選肽Pep3對D-氨基半乳糖(GalN)與細菌脂多糖(LPS)共處理引起小鼠急性肝損傷的保護作用。 方法: 1.選用雄性昆明小鼠,以GalN1000mg/kg、LPS100μg/kg腹腔內(nèi)一次注射制備急性肝損傷模型。 2.治療組于GalN/LPS共處理前30min和處理后30min分別經(jīng)腹腔注射給予Pep3(20mg/k
17、gand10mg/kg)。 3.于GalN/LPS共處理1h后摘眼球取血,檢測血清中TNF-α的水平。 4.于GalN/LPS共處理6h后剖殺動物測定肝臟組織勻漿,檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量變化;并取肝臟組織做病理切片檢查。 結(jié)論:成功建立GalN/LPS引起小鼠急性肝損傷模型,Pep3通過抑制血清中TNF—α的活性,從而對GalN/LPS引起的
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