三型腫瘤壞死因子alpha條件性表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、腫瘤壞死因子α(Tumour necrosis factor alpha,TNF-α)是一種具有多樣生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,其以26kD跨膜形式表達(dá)在細(xì)胞表面,稱跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α,tmTNF-α)。tmTNF-α經(jīng)TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TNF-α converting enzyme,TACE)剪切,釋放其胞外段而成為17kD分泌型TNF-α(secretory TNF-α,sTNF-α)。本實(shí)驗(yàn)室前期研

2、究證實(shí)tmTNF-α與sTNF-α在炎癥中起著不同的作用,sTNF-α主要通過TNFR1發(fā)揮促炎作用,而tmTNF-α可能主要通過TNFR2發(fā)揮抑炎作用。
　　為了更加深入的研究?jī)尚蚑NF-α在非可控性炎癥惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤過程中所起的所用及其機(jī)制,我們構(gòu)建了野生型、跨膜型和分泌型TNF-α條件性表達(dá)載體,進(jìn)行體外表達(dá)并用以制備轉(zhuǎn)基因小鼠,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建三型TNF-α條件性表達(dá)載體:

3、
　　通過分子生物學(xué)的方法將野生型wtTNF-α、跨膜型tmTNF-α和分泌型sTNF-αcDNA片段插入到條件性表達(dá)載體pBSA-IRES-GFP中,經(jīng)測(cè)序等方法證實(shí)成功構(gòu)建pBSA-wttnf-IRES-GFP,pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP三種TNF-α條件性表達(dá)載體。
　　2.構(gòu)建CRE真核表達(dá)載體:
　　為驗(yàn)證三型TNF-α條件性表達(dá)載體的真核表達(dá),構(gòu)建CRE真核

4、表達(dá)載體。利用PCR從CMV-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA中釣取CREDNA片段,并將之插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中,經(jīng)測(cè)序等方法證實(shí)成功構(gòu)建pcDNA-CRE真核表達(dá)載體。
　　3.體外條件性表達(dá)三型TNF-α:
　　將pcDNA-CRE分別與上述三種TNF-α條件性表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染,通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-tmtnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)tmTNF-α明顯高于p

5、BSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞;并且三種共轉(zhuǎn)染組均較高表達(dá)綠色熒光。而單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE的細(xì)胞未檢測(cè)到tmTNF-α及綠色熒光表達(dá)。此外,用ELISA證實(shí)pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌sTNF-α明顯高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP

6、共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提示野生型TNF-α基因表達(dá)兩型TNF-α,跨膜型TNF-α突變體僅表達(dá)tmTNF-α,分泌型TNF-α突變體則僅表達(dá)sTNF-α。
　　4.MTT證實(shí)sTNF-α的殺傷效應(yīng):
　　利用MTT分別檢測(cè)CRE與上述三型TNF共轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清對(duì)L929細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的殺傷率明顯高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP共

7、轉(zhuǎn)染組,并且其殺傷作用能被TNF-α特異性抗體所封閉。而單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE細(xì)胞上清對(duì)L929細(xì)胞幾乎無殺傷作用。
　　5.MTT證實(shí)tmTNF-α的殺傷效應(yīng):
　　用MTT分別檢測(cè)CRE與上述三型TNF共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察這些效應(yīng)細(xì)胞對(duì)L929細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示pBSA-wttnf-IRES-GFP或

8、pBSA-tmtnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)L929細(xì)胞殺傷率明顯高于pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,且其殺傷活性能被TNF-α特異性抗體所封閉。但單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE細(xì)胞對(duì)L929細(xì)胞無明顯胞毒效應(yīng)。
　　6.獲得野生型TNF轉(zhuǎn)基因小鼠:
　　將構(gòu)建成功的質(zhì)粒委托給廣州賽業(yè)公司,經(jīng)

9、過基因組PCR驗(yàn)證表明已成功制備野生型TNF轉(zhuǎn)基因小鼠。將轉(zhuǎn)基因小鼠與全身廣泛表達(dá)CRE的CMV-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠交配,2窩共獲F1代14只,經(jīng)基因組PCR證實(shí)其中4只小鼠獲得TNF基因,但CRE基因陰性;8只小鼠獲得CRE基因,但TNF基因陰性;其余2只小鼠則為雙陰性,尚未獲得雙基因陽(yáng)性小鼠。另外兩個(gè)品系(pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠正在制備中。
　　本研究結(jié)果為深入研