大腸埃希菌Afa-Dr家族粘附素afa-draC基因片段的序列分析及流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、目的：
　　 Afa/Dr家族粘附素主要表達(dá)于引發(fā)泌尿系統(tǒng)感染和嬰幼兒慢性腹瀉的尿道致病性大腸埃希菌和彌漫粘附性大腸埃希菌，與泌尿系統(tǒng)感染、感染性腹瀉、呼吸系統(tǒng)以及其他系統(tǒng)的感染密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌臨床分離株為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)方法，檢測大腸埃希菌臨床株Afa/Dr家族粘附素afa/draC基因片段的序列，明確是否存在突變位點(diǎn)，并應(yīng)用Primer Premier5軟件分析比對(duì)上述測序結(jié)果與相應(yīng)的氨基酸序列變化情況；

2、并對(duì)分離自泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的大腸埃希菌Afa/Dr家族粘附素?cái)y帶率進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，為大腸埃希菌感染的臨床防治探索可能的、新的思路。
　　 方法：
　　 1、菌株的收集、鑒定：收集2007年7月至2009年7月期間天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌，以及2009年5月至2009年10月期間于該院腸道門診收集的部分腹瀉病人便培養(yǎng)分離出的大腸埃希菌。采用常規(guī)的生化鑒定方法對(duì)收集菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
　

3、　 2、afa/draC基因片段PCR擴(kuò)增、T-A克隆后序列分析：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增20株臨床分離的大腸埃希菌afa/draC基因片段，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，T-A克隆后對(duì)克隆子再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)，并將所測DNA序列翻譯成氨基酸序列，分析氨基酸序列是否發(fā)生相應(yīng)變化。
　　 3、大腸埃希菌Afa/Dr家族粘附素的流行病學(xué)調(diào)查：PCR方法擴(kuò)增全部實(shí)驗(yàn)菌株的af

4、a/draC基因片段，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件中卡方檢驗(yàn)的方法，分析比較不同部位來源的大腸埃希菌afa/draC基因檢出率有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、共收集大腸埃希菌600株，其中尿道分離菌261株，腸道分離菌244株，呼吸道分離菌22株，以及其他分泌物（血液、腹水等）分離菌73株。
　　 2、afa/draC基因片段PCR擴(kuò)增、T-A克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，50株臨床分離的大腸埃希

5、菌中20株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶位置與陽性對(duì)照菌的產(chǎn)物條帶位置相符；T-A克隆后通過藍(lán)白斑篩選方法得到克隆子-白色菌落，以克隆子DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行序列分析；序列分析顯示：20株臨床分離菌株afa/draC基因片段序列與陽性對(duì)照株對(duì)比具有高度同源性（大于99％）；所測菌株均存在3～4處基因變異，變異位點(diǎn)分別為284G→T、308T→C、600T→C和620C→G且變異位點(diǎn)存在高度一致性；根據(jù)基因推導(dǎo)氨基酸序列并進(jìn)行氨基酸比

6、對(duì)后出現(xiàn)氨基酸的替代：Pro184→Ser和Gln190→His。
　　 3、在收集到的600株大腸埃希菌中，402株檢測出該基因片段，其中，186株泌尿道分離菌，169株消化道分離菌，22株呼吸道分離菌，以及34株其他分泌物分離菌攜帶該基因片段，其攜帶率分別為71.26％、69.55％、59.09％、46.58％。將其攜帶率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)，只有泌尿道分離菌和消化道分離菌分別與其他分泌物分離菌的攜帶率比較時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

7、<0.05），其他各組別間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、20株大腸埃希菌臨床分離菌株afa/draC基因片段序列與陽性對(duì)照株對(duì)比具有高度同源性（大于99％），但所測菌株均存在3～4處基因變異，且變異位點(diǎn)存在高度一致性。因?yàn)閿U(kuò)增片段只占afa/draC全基因長度的26.05％，據(jù)此推測afa/draC基因全序列可能存在其他變異?；蛭稽c(diǎn)變異導(dǎo)致部分相應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)生替換。大腸埃希菌afa/draC基因位

8、點(diǎn)的突變有可能是由于地域不同、生理環(huán)境不同所產(chǎn)生的正常差異，屬于基因位點(diǎn)變異。這種變異所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)氨基酸改變有可能不會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。
　　 2、600株臨床分離的大腸埃希菌Afa/Dr家族粘附素?cái)y帶率為67.00％，泌尿道、消化道和呼吸道來源的大腸埃希菌之間攜帶率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是前兩者該家族粘附素的攜帶率分別高于其他來源的大腸埃希菌。這說明該家族粘附素是大腸埃希菌的一個(gè)主要的粘附素種類，在致病過程中具有十分重要作