人乳頭瘤病毒(HPV)16,-18,-58型單克隆抗體的制備分析及初步應用.pdf

1、在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是婦女第二位高發(fā)的惡性腫瘤。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，在經(jīng)濟落后地區(qū)，宮頸癌的危害更為嚴重。慢性高危型人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)的感染是宮頸癌的主要誘因。此外，低危型HPV中的HPV-6，-11可誘發(fā)90％的生殖器疣。在世界范圍內(nèi)，高危型HPV-16、-18是位居前兩位的優(yōu)勢流行病毒株，誘發(fā)約70％的宮頸癌。在我國，除HPV-16，-18外（檢出率分別為58.7％和11％），高危型HP

2、V-58的檢出率也很高(7.2％)，居于第三位。因此，針對HPV-16，-18，-58疫苗的相關研究值得重視。
　　 目前國外已有兩種HPV L1病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)疫苗上市，分別是Merck公司利用酵母表達體系生產(chǎn)的含四價疫苗(HPV-16、-18、-6、-11 L1VLPs)，及GSK公司利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達生產(chǎn)的二價疫苗(HPV-16、-18L1VLPs)。臨床實驗結果顯示

3、，兩種疫苗均具有很好的安全性、免疫原性及保護性，而且疫苗的免疫保護活性與疫苗接種血清中和抗體的水平具有很好的相關性。由于HPV感染嚴格限制在人的上皮組織、生活周期為上皮分化依賴的，體外難以大量培養(yǎng)獲得病毒顆粒，缺乏有效的動物模型，因此準確評價疫苗接種人群后誘發(fā)的血清中和抗體水平存在很大的困難。另外，和大多數(shù)基因工程蛋白不同，HPV L1 VLPs屬于高度組裝的重組蛋白，誘發(fā)的保護性抗體識別的表位大多是L1蛋白構象依賴的。變性或錯誤折疊的

4、L1蛋白不具有保護活性，其越接近天然病毒，保護活性越高，因此在疫苗研制過程中需要對體外表達獲得的L1重組蛋白的活性進行檢測。HPV中和單抗可用于檢測L1重組蛋白中誘發(fā)保護性抗體的活性位點。H16.V5和H18.J4分別是國外報道的HPV-16、-18型特異性構象表位依賴中和單抗，均已被應用于ELISA方法對HPV-16、-18 L1 VLPs疫苗生產(chǎn)過程中的有效成分的質(zhì)量控制;此外H16.V5和H18.J4還被用于建立競爭性免疫分析方法

5、(Competitive Lumineximmunoassay，cLIA)，對免疫人群產(chǎn)生的HPV-16、-18型特異性中和抗體進行高通量評價，結果顯示基于H16.V5的cLIA方法靈敏，檢測結果與中和抗體實際水平一致;但基于H18.J4的cLIA方法的靈敏度較差，某些cLIA陰性血清中仍可檢測到HPV-18中和抗體，有待于進一步優(yōu)化;目前未見有包含HPV-58 VLPs的疫苗問世，也未見有HPV-58單抗應用于疫苗研究的報道。

6、　　 對HPV感染機制的初步研究結果表明L1蛋白包含多個涉及病毒感染入胞的關鍵位點，目前這些位點的序列特征尚不清楚，對其進一步的研究需要多種不同類型單抗的輔助。本實驗室正在研發(fā)包含HPV-16、-18、-58型多價L1 VLPs混合性疫苗，為了配合適合我國國情L1 VLPs疫苗的研發(fā)，本研究采用雜交瘤技術，制備針對HPV-16、-18、-58的中和單抗，分析了抗體的中和活性即具有50％感染抑制率時的單抗?jié)舛龋?0％ inhibitor

7、y concentrations，IC50）、單抗表位特征、單抗間及單抗與H16.V5、H18.J4標準株的識別表位是否一致等。在此基礎上建立了基于HPV-16中和單抗的雙抗夾心ELISA方法，對L1 VLPs進行定量檢測。研究結果為HPV-16、-18、-58 L1 VLPs疫苗的研發(fā)及HPV感染入胞機制的深入研究打下了基礎。
　　 獲得了10株HPV-16構象表位依賴中和單抗，IC50范圍為0.03-1.72 nM。所識別表

8、位的性質(zhì)與H16.V5一樣依賴于病毒子粒;相加實驗顯示除XM16-1和XM16-5、XM16-3和XM16-6疑似分別識別相同表位外，其它單抗的識別表位均不同，且與H16.V5的表位不同;交叉中和活性分析顯示，除XM16-17可交叉中和HPV-18外，其余均為型特異性中和單抗。還獲得了10株線性表位依賴中和單抗，IC50范圍為1.78-4.17 nM，其中有5株可交叉中和HPV-18和/或-58，如XM16-13、XM16-16、XM1

9、6-20可交叉中和HPV-18，XM16-15可交叉中和HPV-58，XM16-14可交叉中和HPV-18、-58。以構象表位依賴單抗XM16-6為捕獲抗體、HRP標記的線性表位依賴單抗XM16-12為酶標抗體建立了雙抗夾心ELISA方法，測定范圍為0.05-1.5μg/mL，穩(wěn)定性好。
　　 獲得了7株HPV-18型特異性構象表位依賴中和單抗，IC50范圍為0.04-0.89 nM。所識別表位性質(zhì)與H18.J4（識別表位依賴于

10、完整VLPs）不同，均為子粒內(nèi)表位;相加實驗結果提示單抗間識別表位均不相同，也不同于H18.J4的識別表位。還獲得了6株線性表位依賴中和單抗，IC50范圍為0.44-2.34 nM，其中3株(XM18-12、XM18-13、XM18-14)可交叉中和HPV-6，其余均為型特異性單抗。
　　 獲得了7株HPV-58型特異性構象表位依賴中和單抗，IC50范圍為0.045-1.0 nM;其中3株單抗(XM58-6、XM58-7、XM5

11、8-8)識別表位依賴于完整VLPs，其余均識別子粒內(nèi)表位;相加實驗結果提示各單抗間識別表位均不同。還獲得了9株線性表位依賴中和單抗，IC50范圍為0.44-1.17 nM;其中XM-21和XM58-14可交叉中和HPV-18，XM-24可交叉中和HPV-6，而XM58-13可交叉中和HPV-11，其余為型特異性單抗。建立了基于線性表位依賴中和單抗XM-22的間接ELIA方法，但該方法穩(wěn)定性欠佳。
　　 結果表明:HPV-16、-

12、18、-58 L1 VLPs構象表位依賴的中和單抗多是型特異性單抗，型特異性中和活性強。絕大多數(shù)構象表位依賴單抗與H16.V5一樣識別表位依賴于子粒，并發(fā)現(xiàn)H18.J4識別表位依賴于完整VLPs，提示研發(fā)獲得的各株子粒依賴單抗在疫苗質(zhì)控及免疫活性檢測中具有潛在的應用價值;首次報道了3株識別表位依賴于完整VLPs的HPV-58型特異性中和單抗。線性表位依賴中和單抗中一半具有交叉中和活性，型特異性中和活性較弱。研究獲得的3株可交叉中和HPV