體外構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管復(fù)合體移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、本研究旨在探討應(yīng)用體外構(gòu)建的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管復(fù)合體移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷，觀察這種治療策略能否更好地促進受損傷脊髓運動功能的恢復(fù)，并分析其中可能的作用機制，為臨床治療急性脊髓損傷提供新策略及其實驗依據(jù)。本研究共分為以下三個部分： 第一部分神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及其在三維空間PLGA生物材料中培養(yǎng) 目的：體外培養(yǎng)和鑒定所培養(yǎng)細胞為神經(jīng)干細胞，并將其種植在三維空間PLGA材料中，繼續(xù)體外培養(yǎng)一段時間，使PLGA材料

2、內(nèi)盡量分布足夠多的細胞。 方法：選用SD乳鼠，取海馬組織，機械吹打法培養(yǎng)NSCs，免疫熒光組織化學(xué)檢測所培養(yǎng)細胞nestin的表達；將NSCs種植在4不同孔隙直徑(0-75μm，75-125μm，125-200μm和200-300μm)，16通道PLGA材料中，分別培養(yǎng)7d和14d。Hoechst33324標(biāo)記細胞，熒光鏡下觀察細胞在不同孔隙直徑材料中的分布。MTT法檢測不同孔隙直徑PLGA材料內(nèi)細胞的活性，間接反映其細胞的數(shù)量

3、。掃描電鏡下觀察孔隙直徑為200-300μm PLGA材料中所含細胞的形態(tài)特征。 結(jié)果：1.體外所培養(yǎng)細胞大部分為nestin陽性細胞。2.Hoechst33342熒光顯示，培養(yǎng)7d時，細胞仍然成團貼附在材料的通道內(nèi)，少有細胞遷移至PLGA材料內(nèi)，而培養(yǎng)14d可見細胞較均勻的分布在材料內(nèi)，同時觀察到，孔隙直徑為0-75μm和75-125μm兩種PLGA材料，容納細胞數(shù)較孔隙直徑為125-200μm和200-300μm少。3.MT

4、T結(jié)果顯示，200-300μm孔隙直徑的PLGA材料內(nèi)細胞活性為各組最高，間接提示其內(nèi)所含細胞數(shù)最多，而培養(yǎng)7d和14d兩種培養(yǎng)方式對同種孔隙直徑材料內(nèi)所含細胞數(shù)并無影響。4.掃描電鏡下，可見一個神經(jīng)球貼附在材料通道內(nèi)，大量的細胞從神經(jīng)球中向PLGA材料內(nèi)遷移，在材料內(nèi)，可見細胞貼附在材料內(nèi)并伸出突起，顯示出PLGA材料良好生物相容性。 結(jié)論：采用機械培養(yǎng)法培養(yǎng)NSCs，體外能在短時間內(nèi)培養(yǎng)出足夠純度和生長狀態(tài)良好的NSCs；P

5、LGA可降解生物材料能顯示出良好生物相容性；體外培養(yǎng)NSCs于孔徑為200-300μm的PLGA材料內(nèi)14d，其存活細胞多且分布較均勻，更符合我們的實驗要求。 第二部分：NT—3基因和NT—3受體基因修飾的神經(jīng)干細胞在三維空間PLGA生物材料中混合培養(yǎng)構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣管道復(fù)合體 目的：在體外三維空間孔隙直徑為200-300μm的PLGA材料中共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了NT—3基因和TrkC基因的NSCs，促使這兩種轉(zhuǎn)基因的NSCs能

6、夠更多地分化為神經(jīng)元樣細胞，并具有突觸形成潛能，并相互建立細胞連接，在體外構(gòu)建一種具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣管道復(fù)合體。 方法：應(yīng)用各種MOI的Ad—GFP感染NSCs，48h后流式細胞儀檢測NSCs的感染率，確定最適感染劑量。實驗共分為6組：單純NSCs組(單純組)；Ad—LacZ—NSCs對照組(LacZ組)；Ad—TrkC—NSCs對照組(TrkC組)；Ad—NT—3-NSCs對照組(NT—3組)；Ad—NT—3-NSCs+

7、 Ad—TrkC—NSCs聯(lián)合組(聯(lián)合組)；聯(lián)合組+ K252a抑制組(抑制組)，將各組NSCs種植在孔隙直徑為200-300μm的PLGA材料中，體外培養(yǎng)14d。運用免疫熒光組織化學(xué)檢測各組Map2、GFAP和MOSP的表達；免疫熒光雙標(biāo)分別檢測synapsin和PSD95的表達；利用細胞胞吞作用攝取FM1-43熒光染料與其突觸小泡的膜表面結(jié)合，在高K+(50mmol/L)刺激下，激光共聚焦顯微鏡下觀察單純組和聯(lián)合組FM1-43熒光顆

8、粒的釋放；同樣在高K+刺激下，免疫熒光雙標(biāo)檢測兩組p—C—jun和βⅢ tubulin的表達；Western blot檢測各組βⅢ tubulin和p—p38的表達；免疫熒光雙標(biāo)檢測聯(lián)合組Map2和4種神經(jīng)遞質(zhì)ChAT、5-HT、Glutamate和GABA的表達；透射電鏡觀察單純組和聯(lián)合組PLGA材料內(nèi)的細胞連接的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1.NSCs最適感染劑量為50 MOI。2.各組NSCs在PLGA材料內(nèi)均可分化為神經(jīng)元樣細胞和

9、神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞，與其它實驗組相比，聯(lián)合組表達Map2神經(jīng)元樣細胞比例最高(77.11％)，NT—3組次之，單純組最低，Western blot檢測βⅢ tubulin的表達也顯示，聯(lián)合組和NT—3組其蛋白含量較其他組高。3.synapsin和PSD95的表達顯示，各組均有兩種陽性細胞的表達，但聯(lián)合組兩種陽性細胞比例最高，在PLGA材料內(nèi)形成豐富的細胞連接。4.激光共聚焦顯微鏡下觀察到聯(lián)合組有大量的FM1-43熒光顆粒的釋放，并且其釋放的

10、強度隨著時間的延長而逐漸減低；在高K+刺激下，聯(lián)合組有大量表達p—C—jun和βⅢ tubulin的雙重標(biāo)記陽性細胞，而單純組則未見其表達。5.聯(lián)合組還檢測到同時表達Map2和ChAT、5-HT、Glutamate和GABA神經(jīng)遞質(zhì)的陽性細胞，但細胞數(shù)量少。6.Western blot檢測p—p—38的表達顯示，聯(lián)合組其蛋白含量水平最高，抑制組最低。7.電鏡下，可觀察到單純組分化為大量神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞，而聯(lián)合組大量分化的神經(jīng)元樣細胞，其突

11、起和突起間建立豐富的細胞連接，并且可見其形成突觸樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：利用攜帶NT—3基因和攜帶其受體基因TrkC的腺病毒分別轉(zhuǎn)染NSCs，共培養(yǎng)種植在孔徑為200-300μm的PLGA生物材料中構(gòu)建出一種具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣管道復(fù)合體。 第三部分：體外構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管復(fù)合體移植促進大鼠脊髓全橫斷損傷修復(fù)的研究 目的：探討利用體外構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管復(fù)合體移植能否促進全橫斷脊髓損傷修復(fù)的研究。 方法

12、：取成年雌性SD大鼠39只，隨機分為7組，分別為：PLGA材料組(材料組)；單純NSCs移植組(單純組)；Ad—LacZ—NSCs移植組(LacZ組)；Ad—TrkC—NSCs移植組(TrkC組)；Ad—NT—3-NSCs移植組(NT—3組)；Ad—NT—3-NSCs+Ad—TrkC—NSCs移植組(聯(lián)合組)；假手術(shù)組，各組神經(jīng)干細胞在移植前分別用Hoechst33342進行標(biāo)記。所有動物存活60d后，進行爬網(wǎng)格測驗和BBB評分，在皮質(zhì)

13、體感區(qū)進行BDA順行標(biāo)記。術(shù)后74d，檢測脊髓運動誘發(fā)電位(SCEP)和脊髓體感誘發(fā)電位(SSEP)。最后灌注固定動物，取材和切片并行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果：1.行為學(xué)檢測顯示，各細胞移植組與材料組相比，能促進大鼠后肢運動功能的恢復(fù)，其中恢復(fù)最好的是聯(lián)合組。2.電生理檢測顯示聯(lián)合組SSEP和SCEP的峰峰值明顯增大，但潛伏期仍然較長。3.中性紅染色后計數(shù)發(fā)現(xiàn)，與實驗對照組相比，聯(lián)合組大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞層、中腦紅核、及脊髓L

14、1背核存活神經(jīng)元數(shù)目均顯著增多，并有統(tǒng)計學(xué)意義。4.各細胞移植組在脊髓損傷處均檢測到Map2、GFAP、MOSP、synaptophsin和PSD95染色陽性細胞，與其他細胞移植組相比，聯(lián)合組Map2和PSD95陽性細胞比例最高。5.免疫熒光組織化學(xué)檢測NF—200和GAP—43表達顯示，與材料組相比，細胞移植組的脊髓橫斷處及附近，均可看到多少不等的NF—200和GAP—43陽性神經(jīng)纖維，其中，聯(lián)合組NF—200陽性神經(jīng)纖維數(shù)量最多。6