骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：盡管眾多研究證實(shí),骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)移植能夠促進(jìn)脊髓損傷(SCI)實(shí)驗(yàn)動物的神經(jīng)功能恢復(fù),但其作用機(jī)制仍然不清。以往的研究大多集中在對BMSCs移植后在損傷脊髓內(nèi)存活、遷移和分化方面的研究,沒有深入探討B(tài)MSCs如何介導(dǎo)脊髓損傷后修復(fù)的機(jī)制,進(jìn)一步明確其治療脊髓損傷的機(jī)制已成為重點(diǎn)。此外,干細(xì)胞用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療最初目的是替代死亡和損傷的神經(jīng)組織,然而,越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示,BMSCs移植到體內(nèi)后,沒有或只有很小

2、比例的BMSCs顯示轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞表型,并且對這些轉(zhuǎn)分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞是否具有相應(yīng)的功能還沒有明確的證據(jù)。因而,這不太可能是BMSCs移植的主要有益作用。因此,有研究者提出,BMSCs移植促進(jìn)脊髓損傷實(shí)驗(yàn)動物神經(jīng)功能改善不能完全用替代死亡和損傷的神經(jīng)細(xì)胞來解釋,其他的作用機(jī)制可能參與脊髓損傷后的修復(fù)。
　　 以往研究證實(shí),BMSCs不但能夠自身分泌包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子和生長因子,而且還能夠刺激內(nèi)源

3、性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),神經(jīng)生長因子(NGF)和VEGF等的表達(dá)。故有理由提出脊髓損傷后BMSCs移植治療所引起的神經(jīng)功能恢復(fù),可能源于這些細(xì)胞因子和生長因子在脊髓損傷修復(fù)過程中所發(fā)揮的有益作用。而研究顯示,一些細(xì)胞因子和生長因子能夠誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2(COX-2)表達(dá)增加,而COX-2是環(huán)氧化酶的一種誘導(dǎo)型酶,以往被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而,近來實(shí)驗(yàn)研究顯示,COX-2與血管生成和神經(jīng)保護(hù)也關(guān)系密切,并能夠誘導(dǎo)VE

4、GF的表達(dá),在創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著積極的作用。而VEGF主要通過與其高親和力酪氨酸激酶受體2,胎肝激酶1(Flk-1),結(jié)合而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)血管生成、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生的作用。因此,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、Western Blot方法、免疫熒光和免疫組化方法,觀察BMSCs移植對損傷脊髓組織內(nèi)COX-2、VEGF、Flk-1基因和蛋白的表達(dá)的影響和對血管生成的作用,旨在探討B(tài)MSCs移植促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的可能作用與機(jī)制,為

5、BMSCs應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1、骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增：取3周大小Wistar大鼠,雄性,體重80～100g。無菌條件取雙側(cè)股骨和脛骨,除去股骨和脛骨兩端,暴露骨髓腔。然后用無菌5ml注射器從骨的一端反復(fù)注入低糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,在另一端收集。將收集的骨髓制成單細(xì)胞懸液。然后用5ml含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液重新懸浮沉淀的細(xì)胞。吹散后調(diào)整細(xì)胞密度,將細(xì)胞

6、稀釋后按2.5x105/cm2密度接種到塑料培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃,濕度95％和5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后通過首次全量換液去除未貼壁的細(xì)胞,以后每隔2～3天換液一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí),0.25％胰蛋白酶37℃消化5min傳代擴(kuò)增。
　　 2、骨髓基質(zhì)細(xì)胞鑒定：CD34、CD44抗體免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
　　 3、實(shí)驗(yàn)動物分組Wistar成年大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組、DMEM組、BMSC

7、s組。
　　 4、脊髓損傷模型和髓內(nèi)注射：參照改良的Taoka/s方法,制作大鼠胸9節(jié)段脊髓壓迫損傷模型。損傷30min后,通過立體定位儀,用微量注射器將第3～4代BMSCs懸液緩慢注入到距脊髓損傷區(qū)頭、尾側(cè)各1.0mm,距中線0.5mm脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)。注射深度分別是1.75mm、1.25mm、0.75mm。每點(diǎn)3μL(75000個(gè)細(xì)胞),每只動物移植的細(xì)胞總數(shù)共3.0x105個(gè)細(xì)胞。依同樣方法DMEM組注射等量DMEM培養(yǎng)液。假手

8、術(shù)組僅暴露相應(yīng)的脊髓節(jié)段,不進(jìn)行脊髓壓迫。
　　 5、檢測方法
　　 (1)采用RT-PCR技術(shù)檢測脊髓組織內(nèi)COX-2mRNA、VEGF mRNA、Flk-1、mRNA的表達(dá)水平。
　　 (2)采用Westem blot方法檢測脊髓組織內(nèi)COX-2和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 (3)采用免疫熒光方法觀察脊髓組織內(nèi)COX-2和VEGF表達(dá)和分布情況。
　　 (4)采用免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓組織內(nèi)

9、Flk-1表達(dá)變化。
　　 (5)采用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色和微血管記數(shù)方法觀察脊髓組織內(nèi)血管生成的情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、原代培養(yǎng)的BMSCs,剛接種時(shí)細(xì)胞種類較多,大部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,后經(jīng)換液去除未貼壁細(xì)胞。72h左右,貼壁細(xì)胞開始增殖并形成細(xì)胞集落,細(xì)胞常圍繞集落中央呈島狀向四周分布,細(xì)胞形態(tài)多樣。消化傳代后,細(xì)胞增值速度加快,隨著傳代代數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)趨于均一,多為長梭形,并呈漩渦

10、或平行狀排列生長。
　　 2、BMSCs免疫細(xì)胞化學(xué)顯示第3代BMSCs呈CD34表達(dá)陰性,CD44表達(dá)陽性。
　　 3、RT-PCR結(jié)果顯示,移植術(shù)后1、3、5d,BMSCs組COX-2mRNA和VEGFmRNA的表達(dá)水平明顯高于DMEM組(P＜0.05);而兩組Flk-1mRNA表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4、Western Blot結(jié)果顯示,BMSCs組在移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(3、

11、7、14d),COX-2蛋白表達(dá)水平顯著高于DMEM組(P＜0.05);移植術(shù)后3d,BMSCs和DMEM兩組VEGF蛋白表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而移植術(shù)后7和14d,BMSCs組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著高于DMEM組(P＜0.05)。
　　 5、免疫熒光結(jié)果顯示,在假手術(shù)組COX-2和VEGF僅表達(dá)于脊髓血管,脊髓損傷后COX-2則表達(dá)在脊髓血管和神經(jīng)元。VEGF則表達(dá)在脊髓血管、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥

12、細(xì)胞。
　　 6、免疫組化結(jié)果顯示,移植術(shù)后3d,BMSCs和DMEM兩組Flk-1表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而移植術(shù)后7和14d,BMSCs組Flk-1表達(dá)水平顯著高于DMEM組(P＜0.05)。
　　 7、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫化學(xué)染色和微血管記數(shù)結(jié)果顯示,BMSCs組與DMEM組相比,移植術(shù)后3和7d,兩組脊髓腹側(cè)灰質(zhì)內(nèi)微血管數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但術(shù)后14d,BMSCs組脊髓腹側(cè)

13、灰質(zhì)內(nèi)的微血管數(shù)目略高于DMEM組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、BMSCs移植能夠增加大鼠損傷脊髓組織內(nèi)COX-2mRNA和蛋白的表達(dá)水平,COX-2的表達(dá)上調(diào)可能在BMSCs修復(fù)脊髓損傷的過程中發(fā)揮積極的作用。
　　 2、BMSCs移植能夠上調(diào)大鼠損傷脊髓組織內(nèi)VEGF mRNA.和蛋白的表達(dá)水平,并延長VEGF蛋白表達(dá)的時(shí)間,是BMSCs修復(fù)脊髓損傷的機(jī)制之一。
　　 3、BMSCs移植