雌激素對順鉑所致人卵巢顆粒細胞毒性的保護作用及其機制研究.pdf

1、一、研究背景: 化療是免疫性疾病和腫瘤治療中的一種重要手段，因其療效確切，故臨床應用廣泛。然而，由于化療藥物對靶細胞的選擇性較差，對正常組織細胞存在著明顯的細胞毒性作用，在殺滅病變細胞的同時對正常組織和細胞也有不同程度的損傷。近年來年輕女性患者因化療而導致卵巢功能低下和不孕的報道日漸增多，成為卵巢功能早衰(prematureovarianfailure，POF)的一個重要原因。 目前鉑類藥物對卵巢的毒性不明確，順鉑(ci

2、splatin，CDDP)是一種臨床上常用的廣譜抗癌藥物，無論是單獨用藥還是聯(lián)合用藥，均顯示出明顯的抗癌作用，屬細胞周期非特異性藥物。但隨著給藥劑量的增加，CDDP對機體的毒副作用也隨之增強，限制了其臨床大劑量使用。其中最嚴重的是腎毒性，其次為耳毒性、肝臟毒性、胃腸道反應及骨髓抑制，而在生殖毒性方面研究較少，且機制尚不十分清楚。近年研究表明，細胞凋亡是化療藥物引起卵巢結(jié)構及功能破壞的重要機制。受化療藥物影響，卵泡內(nèi)一些特定的信號被激活而

3、促使細胞發(fā)生凋亡，其中大中卵泡尤其是生長卵泡中顆粒細胞的異常凋亡，可導致卵泡提前閉鎖，因此抑制顆粒細胞的異常凋亡就有可能保護卵巢功能。 大量的研究資料證實生殖激素在控制卵泡功能方面具有非常重要的地位，但生殖激素及相關因素種類繁多，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡和控制機理十分復雜，目前確切的激素調(diào)控機制還需深入探討。雌激素作為卵巢分泌的主要激素之一，具有重要的生理功能。傳統(tǒng)的性激素治療卵巢功能早衰主要是為了改善患者圍絕經(jīng)期癥狀，降低血清降低血清卵泡刺激

4、素(FSH)、黃體生成素(LH)水平，升高雌激素水平。目前的動物實驗表明：雌激素可以抑制多種組織細胞的凋亡，如內(nèi)皮細胞、外周血單核細胞、神經(jīng)細胞、骨細胞、心肌細胞等，說明雌激素可以通過不同的機制對不同的細胞產(chǎn)生抗凋亡作用。那么，雌激素對化療所致的卵巢顆粒細胞毒性是否有保護作用，進而對化療導致的卵巢功能損傷是否可以起到減輕或保護作用?其可能的機制是什么?這些都有待于我們進一步深入的研究和探討。 二、研究目的: 本實驗通過體

5、外原代培養(yǎng)人卵巢顆粒細胞，建立卵巢顆粒細胞培養(yǎng)體系為深入研究POF建立細胞平臺；初步研究化療藥物CDDP對卵巢顆粒細胞的毒性以及凋亡的影響；以細胞凋亡為切入點，探討雌激素對CDDP所致卵巢顆粒細胞毒性的保護作用及其可能的機制。 三、材料與方法: 1.顆粒細胞來源2007年4～9月間，從在南方醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖中心接受體外授精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕患者廢棄的卵泡液中分離取得顆粒細胞?；颊吣挲g27～35歲，有

6、排卵證據(jù)，基礎狀態(tài)生殖激素水平正常，均為輸卵管因素或男方因素所致的不孕。 2.CDDP對卵巢顆粒細胞體外增殖的抑制實驗實驗分6組：正常組及分別加入不同濃度(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0)mg·L-1的CDDP(山東魯南制藥廠生產(chǎn)，粉針劑，10mg/支，批號0411042)與卵巢顆粒細胞共培養(yǎng)的另5組。培養(yǎng)48小時后，采用噻唑藍(3,[4,5-dimehylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyl-tetr

7、azoliumbromide,MTT)法分別檢測各組的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算抑制率，并求出CDDP對顆粒細胞的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration,IC50)，后續(xù)實驗應用IC50為CDDP的實驗濃度。 3.CDDP聯(lián)用17β-雌二醇對顆粒細胞體外增殖的影響實驗分5組：IC50的CDDP組、IC50的CDDP同時分別加用濃度為(1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-10)mol·L

8、-1的17β-雌二醇另4組(17β-Estradio，17β-E2購自美國CaymanChemical公司，粉劑，純度>98％)。培養(yǎng)48小時后，采用MTT法，檢測各組的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算抑制率。 4.Hochest33258染色并于熒光顯微鏡下觀察顆粒細胞凋亡的形態(tài)學特征實驗分3組：正常卵巢顆粒細胞組、IC50的CDDP卵巢顆粒細胞組、CDDP聯(lián)用17p-E2卵巢顆粒細胞組。培養(yǎng)48小時后，棄培養(yǎng)液，經(jīng)Hochest3

9、3258染色，熒光顯微鏡下觀察凋亡卵巢顆粒細胞形態(tài)學特征。 5.流式細胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測顆粒細胞的細胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達實驗分3組：正常組、IC50的CDDP組、CDDP聯(lián)用17β-E2組。卵巢顆粒細胞培養(yǎng)48小時后，離心收集細胞，經(jīng)固定后用流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達情況。 采用SPSS11.

10、5統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)：所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，卵巢顆粒細胞抑制率、細胞周期、凋亡率及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達率均采用One-WayANOVA分析。若方差齊，組間比較用Student-Neuman-Keuls；若方差不齊，組間比較采用Tambane'sT2，以P<0.05為具有顯著性。 四、結(jié)果: 1.卵巢顆粒細胞24小時內(nèi)貼壁，倒置顯微鏡下觀察到細胞呈不規(guī)則形或星形生長，細胞與細胞之

11、間有延長的絲狀突起相互連接。細胞核大、圓，胞質(zhì)富含顆粒及空泡。 2.CDDP抑制卵巢顆粒細胞生長，其抑制作用隨藥物濃度增加而更加明顯。當CDDP濃度為0.5mg·L-1時，IR為(0.13±0.02)％；對卵巢顆粒細胞無明顯抑制作用(P=0.114)，當CDDP濃度為1mg·L-1時，IR為(9.20±0.66)％，顯示抑制卵巢顆粒細胞生長，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025)；當CDDP濃度≥2.5mg·L-1時，I

12、R為(20.98±0.86)％，明顯抑制卵巢顆粒細胞生長，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。求出IC50的CDDP濃度為4.9mg·L-1。 3.IC50的CDDP濃度同時聯(lián)用不同濃度的17β-E2，實驗結(jié)果示：隨著雌激素濃度的增加，CDDP所致卵巢顆粒細胞的抑制率逐漸降低；低濃度(1×10-10m01·L-1’)的17β-E2對這種抑制無明顯影響，與IC50的CDDP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.113)；≥1×10

13、-8mol·L-1的17β-E2可明顯降低CDDP對卵巢顆粒細胞的抑制率，與IC50的CDDP組比較有顯著性差異(P<0.01)，因此將1×10-8mol·L-117β-E2作為雌激素的最低有效藥物濃度。 4.在熒光顯微鏡下，正常卵巢顆粒細胞核呈均勻的藍色熒光。出現(xiàn)凋亡時，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的亮藍色，甚至見亮藍色碎片。 5.當給予IC50的CDDP后，卵巢顆粒細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡峰，而加入17β-E2后凋亡峰明

14、顯減低。與正常組比較，G0/G1期這一階段，CDDP組卵巢顆粒細胞百分比顯著高于正常組(P=0.000)；而S期和G2/M期這2個階段的CDDP組卵巢顆粒細胞百分比均顯著低于正常組(P=0.000)：CDDP聯(lián)用17β-E2組與正常組比較，在G0/G1期、S期及G2/M期這3個階段中，每一階段的卵巢顆粒細胞百分比與正常組比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。細胞凋亡比較中，CDDP組卵巢顆粒細胞凋亡率為(6.96±0.78)％，與正常組比

15、較顯著增加(P=0.000)，而CDDP+17β-E2組卵巢顆粒細胞凋亡率為(1.49±0.29)％較CDDP組顯著降低(P=0.000)，并接近于正常對照組(1.93±0.18)％水平(P=0.310)。 6.促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達結(jié)果：CDDP組卵巢顆粒細胞bax蛋白表達(52.66±1.77)％，較正常組(30.72±1.00)％顯著增加(P=0.000)，bcl-2蛋白表達(39.67±0.67

16、)％，較正常組(62.10±1.21)％顯著下降(P=0.000)。而CDDP聯(lián)用17β-E2組bax蛋白表達為(29.80±0.91)％、bcl-2蛋白表達為(60.49±0.79)％，與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 五、結(jié)論: 1.化療藥物CDDP抑制卵巢顆粒細胞體外增殖，且在一定濃度范圍內(nèi)有劑量依賴關系；雌激素可以減輕順鉑對卵巢顆粒細胞的抑制作用。 2.CDDP對卵巢顆粒細胞周期的影響，主

17、要是G0/G1期阻滯，其與細胞損傷、存活及凋亡密切相關。 3.雌激素可降低CDDP對卵巢顆粒細胞G0/G1期的阻滯，從而使卵巢顆粒細胞凋亡率降低，這可能是雌激素降低化療所致卵巢顆粒細胞凋亡的機制之一。 4.CDDP誘導卵巢顆粒細胞凋亡，其中促凋亡基因bax低表達和抑凋亡基因bcl-2過表達可能是其誘導凋亡的部分機制。 5.雌激素抑制了卵巢顆粒細胞促凋亡基因bax的表達，從而減少了凋亡，保護了卵巢顆粒細胞，延緩了卵