雌激素對(duì)順鉑所致人卵巢顆粒細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景: 化療是免疫性疾病和腫瘤治療中的一種重要手段，因其療效確切，故臨床應(yīng)用廣泛。然而，由于化療藥物對(duì)靶細(xì)胞的選擇性較差，對(duì)正常組織細(xì)胞存在著明顯的細(xì)胞毒性作用，在殺滅病變細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常組織和細(xì)胞也有不同程度的損傷。近年來(lái)年輕女性患者因化療而導(dǎo)致卵巢功能低下和不孕的報(bào)道日漸增多，成為卵巢功能早衰(prematureovarianfailure，POF)的一個(gè)重要原因。 目前鉑類藥物對(duì)卵巢的毒性不明確，順鉑(ci

2、splatin，CDDP)是一種臨床上常用的廣譜抗癌藥物，無(wú)論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥，均顯示出明顯的抗癌作用，屬細(xì)胞周期非特異性藥物。但隨著給藥劑量的增加，CDDP對(duì)機(jī)體的毒副作用也隨之增強(qiáng)，限制了其臨床大劑量使用。其中最嚴(yán)重的是腎毒性，其次為耳毒性、肝臟毒性、胃腸道反應(yīng)及骨髓抑制，而在生殖毒性方面研究較少，且機(jī)制尚不十分清楚。近年研究表明，細(xì)胞凋亡是化療藥物引起卵巢結(jié)構(gòu)及功能破壞的重要機(jī)制。受化療藥物影響，卵泡內(nèi)一些特定的信號(hào)被激活而

3、促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中大中卵泡尤其是生長(zhǎng)卵泡中顆粒細(xì)胞的異常凋亡，可導(dǎo)致卵泡提前閉鎖，因此抑制顆粒細(xì)胞的異常凋亡就有可能保護(hù)卵巢功能。 大量的研究資料證實(shí)生殖激素在控制卵泡功能方面具有非常重要的地位，但生殖激素及相關(guān)因素種類繁多，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和控制機(jī)理十分復(fù)雜，目前確切的激素調(diào)控機(jī)制還需深入探討。雌激素作為卵巢分泌的主要激素之一，具有重要的生理功能。傳統(tǒng)的性激素治療卵巢功能早衰主要是為了改善患者圍絕經(jīng)期癥狀，降低血清降低血清卵泡刺激

4、素(FSH)、黃體生成素(LH)水平，升高雌激素水平。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：雌激素可以抑制多種組織細(xì)胞的凋亡，如內(nèi)皮細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，說(shuō)明雌激素可以通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)不同的細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用。那么，雌激素對(duì)化療所致的卵巢顆粒細(xì)胞毒性是否有保護(hù)作用，進(jìn)而對(duì)化療導(dǎo)致的卵巢功能損傷是否可以起到減輕或保護(hù)作用?其可能的機(jī)制是什么?這些都有待于我們進(jìn)一步深入的研究和探討。 二、研究目的: 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體

5、外原代培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞，建立卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)體系為深入研究POF建立細(xì)胞平臺(tái)；初步研究化療藥物CDDP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性以及凋亡的影響；以細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，探討雌激素對(duì)CDDP所致卵巢顆粒細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 三、材料與方法: 1.顆粒細(xì)胞來(lái)源2007年4～9月間，從在南方醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心接受體外授精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕患者廢棄的卵泡液中分離取得顆粒細(xì)胞?；颊吣挲g27～35歲，有

6、排卵證據(jù)，基礎(chǔ)狀態(tài)生殖激素水平正常，均為輸卵管因素或男方因素所致的不孕。 2.CDDP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞體外增殖的抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分6組：正常組及分別加入不同濃度(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0)mg·L-1的CDDP(山東魯南制藥廠生產(chǎn)，粉針劑，10mg/支，批號(hào)0411042)與卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的另5組。培養(yǎng)48小時(shí)后，采用噻唑藍(lán)(3,[4,5-dimehylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyl-tetr

7、azoliumbromide,MTT)法分別檢測(cè)各組的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率，并求出CDDP對(duì)顆粒細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration,IC50)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用IC50為CDDP的實(shí)驗(yàn)濃度。 3.CDDP聯(lián)用17β-雌二醇對(duì)顆粒細(xì)胞體外增殖的影響實(shí)驗(yàn)分5組：IC50的CDDP組、IC50的CDDP同時(shí)分別加用濃度為(1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-10)mol·L

8、-1的17β-雌二醇另4組(17β-Estradio，17β-E2購(gòu)自美國(guó)CaymanChemical公司，粉劑，純度>98％)。培養(yǎng)48小時(shí)后，采用MTT法，檢測(cè)各組的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率。 4.Hochest33258染色并于熒光顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征實(shí)驗(yàn)分3組：正常卵巢顆粒細(xì)胞組、IC50的CDDP卵巢顆粒細(xì)胞組、CDDP聯(lián)用17p-E2卵巢顆粒細(xì)胞組。培養(yǎng)48小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，經(jīng)Hochest3

9、3258染色，熒光顯微鏡下觀察凋亡卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。 5.流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分3組：正常組、IC50的CDDP組、CDDP聯(lián)用17β-E2組。卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，經(jīng)固定后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)情況。 采用SPSS11.

10、5統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)：所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，卵巢顆粒細(xì)胞抑制率、細(xì)胞周期、凋亡率及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)率均采用One-WayANOVA分析。若方差齊，組間比較用Student-Neuman-Keuls；若方差不齊，組間比較采用Tambane'sT2，以P<0.05為具有顯著性。 四、結(jié)果: 1.卵巢顆粒細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)貼壁，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈不規(guī)則形或星形生長(zhǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞之

11、間有延長(zhǎng)的絲狀突起相互連接。細(xì)胞核大、圓，胞質(zhì)富含顆粒及空泡。 2.CDDP抑制卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用隨藥物濃度增加而更加明顯。當(dāng)CDDP濃度為0.5mg·L-1時(shí)，IR為(0.13±0.02)％；對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用(P=0.114)，當(dāng)CDDP濃度為1mg·L-1時(shí)，IR為(9.20±0.66)％，顯示抑制卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)；當(dāng)CDDP濃度≥2.5mg·L-1時(shí)，I

12、R為(20.98±0.86)％，明顯抑制卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。求出IC50的CDDP濃度為4.9mg·L-1。 3.IC50的CDDP濃度同時(shí)聯(lián)用不同濃度的17β-E2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：隨著雌激素濃度的增加，CDDP所致卵巢顆粒細(xì)胞的抑制率逐漸降低；低濃度(1×10-10m01·L-1’)的17β-E2對(duì)這種抑制無(wú)明顯影響，與IC50的CDDP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.113)；≥1×10

13、-8mol·L-1的17β-E2可明顯降低CDDP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的抑制率，與IC50的CDDP組比較有顯著性差異(P<0.01)，因此將1×10-8mol·L-117β-E2作為雌激素的最低有效藥物濃度。 4.在熒光顯微鏡下，正常卵巢顆粒細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光。出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的亮藍(lán)色，甚至見(jiàn)亮藍(lán)色碎片。 5.當(dāng)給予IC50的CDDP后，卵巢顆粒細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡峰，而加入17β-E2后凋亡峰明

14、顯減低。與正常組比較，G0/G1期這一階段，CDDP組卵巢顆粒細(xì)胞百分比顯著高于正常組(P=0.000)；而S期和G2/M期這2個(gè)階段的CDDP組卵巢顆粒細(xì)胞百分比均顯著低于正常組(P=0.000)：CDDP聯(lián)用17β-E2組與正常組比較，在G0/G1期、S期及G2/M期這3個(gè)階段中，每一階段的卵巢顆粒細(xì)胞百分比與正常組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。細(xì)胞凋亡比較中，CDDP組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率為(6.96±0.78)％，與正常組比

15、較顯著增加(P=0.000)，而CDDP+17β-E2組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率為(1.49±0.29)％較CDDP組顯著降低(P=0.000)，并接近于正常對(duì)照組(1.93±0.18)％水平(P=0.310)。 6.促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果：CDDP組卵巢顆粒細(xì)胞bax蛋白表達(dá)(52.66±1.77)％，較正常組(30.72±1.00)％顯著增加(P=0.000)，bcl-2蛋白表達(dá)(39.67±0.67

16、)％，較正常組(62.10±1.21)％顯著下降(P=0.000)。而CDDP聯(lián)用17β-E2組bax蛋白表達(dá)為(29.80±0.91)％、bcl-2蛋白表達(dá)為(60.49±0.79)％，與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 五、結(jié)論: 1.化療藥物CDDP抑制卵巢顆粒細(xì)胞體外增殖，且在一定濃度范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系；雌激素可以減輕順鉑對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的抑制作用。 2.CDDP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞周期的影響，主

17、要是G0/G1期阻滯，其與細(xì)胞損傷、存活及凋亡密切相關(guān)。 3.雌激素可降低CDDP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞G0/G1期的阻滯，從而使卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率降低，這可能是雌激素降低化療所致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。 4.CDDP誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，其中促凋亡基因bax低表達(dá)和抑凋亡基因bcl-2過(guò)表達(dá)可能是其誘導(dǎo)凋亡的部分機(jī)制。 5.雌激素抑制了卵巢顆粒細(xì)胞促凋亡基因bax的表達(dá)，從而減少了凋亡，保護(hù)了卵巢顆粒細(xì)胞，延緩了卵