人卵巢壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞表達多種細胞因子的研究.pdf

1、本文對人卵巢壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞表達多種細胞因子進行了研究，文章主要分以下幾部分展開： 第一部分人卵巢黃素化壁層顆粒細胞多種細胞因子的表達與卵巢反應性及臨床妊娠的關系 【研究目的】 研究在體外受精一胚胎移植過程中獲取的人卵巢黃素化壁層顆粒細胞(mural granulosa cells，MGC)分泌IL-1α、IL-1α、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin和bFGF，探討多種

2、細胞因子表達水平與超促排卵的卵巢反應性及臨床妊娠的關系。 【材料和方法】 1．壁層顆粒細胞標本人黃素化壁層顆粒細胞取自2006年3月至9月在南方醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療婦女的卵泡液，共32例，均為輸卵管因素或男方因素不孕者。 2．壁層顆粒細胞體外培養(yǎng)經(jīng)拾卵后的所有卵泡穿刺液，用Percoll梯度離心法分離壁層顆粒細胞。根據(jù)取卵時平均直徑在14mm以上的卵泡數(shù)不同，將患者分為卵巢高反應、正常反應和低反應3種類

3、型，即高反應型卵泡數(shù)=14個，正常反應型卵泡數(shù)5～13個，低反應型卵泡數(shù)=4個。按胚胎移植后35天B超檢查見胎心搏動分為妊娠組，反之，為未妊娠組。 3．Luminex system(LumAvidin Beads)檢測運行Luminex檢測細胞培養(yǎng)上清液中9種細胞因子：IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的濃度。 【統(tǒng)計方法】 利用SPSS10.0軟

4、件進行統(tǒng)計學處理，獨立樣本t檢驗比較≤35歲和≥36歲組，妊娠組和非妊娠組組間因子水平的差異。方差分析分析卵巢反應組間因子表達量的差異，用偏相關分析各細胞因子表達量之間，細胞因子與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)和雌二醇之間的相關性。P=0.05差異有統(tǒng)計學意義。 【結果】 1．≤35歲組與≥36歲組的IVF患者MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF有統(tǒng)計學差異(P=0.05)。 2. IL-1a、IL-6、V

5、EGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇相關關系顯著，相關密切。IL-1β、bFGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)相關關系顯著，相關密切(P=0.05)。 3．根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同進行卵巢反應性分組，卵泡直徑為14mm以上的卵泡數(shù)≤3個為卵巢低反應組，卵泡數(shù)4～13個為卵巢中反應組，≥14個為卵巢高反應組。在卵巢反應分組中，IL-1a、IL-1β、IL-1ra、lL-6、VEGF、lcptin和bFGF在組間有顯著差異(P=0.05)，余因

6、子水平未見差異(P>0.05)。 4．在卵巢正常反應組中，IL-1α和IL-6，IL-1β和IL-1ra、IL-6，IL-1ra與IL-6，IL-6與VEGF相關關系顯著，相關密切(P=0.05)。IL-6和leptin負相關關系顯著，相關密切(P=0.05)。 5．妊娠組與非妊娠組的獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇均沒有統(tǒng)計學差異。兩組比較，前者MGC的IL-1ra、EGF分泌水平低于后者，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，而I

7、L-1a、IL-1β、IL-6、VEGF水平高于后者，余因子水平未見統(tǒng)計學差異。 【結論】 1．隨著年齡的增加，高齡患者的MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF降低。 2．IL-1α、IL-1βB、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在不同的卵巢反應組間有顯著差異，提示上述細胞因子與超促排卵的卵巢反應性有關。高反應組的MGC分泌更多的細胞因子。 3．通過IVF治療獲得妊

8、娠的婦女比未妊娠者MGC分泌更高的IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，而IL-1ra和EGF則相反。提示IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，有利于卵母細胞發(fā)育及以后的胚胎生長發(fā)育。 4．Lumincx液相蛋白芯片分析系統(tǒng)具有靈活性好、通量大、靈敏度高、信噪比好的特點，能同時檢測到同一樣本多個極微量的分子蛋白，比其它的檢測方法具有更多優(yōu)勢。 第二部分人卵丘細胞多種細胞因子的表達與卵巢反應性及臨床妊娠的關系

9、 【研究目的】 研究體外培養(yǎng)的卵丘細胞(cumulus cells，CC)分泌IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、lcptin、bFGF的水平，探討上述多種細胞因子表達與卵巢反應性及臨床妊娠的關系。 【材料和方法】 1．卵丘細胞標本人卵丘顆粒細胞取自在南方醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的婦女，共13例，均為輸卵管因素或男方因素不孕者。 2．卵丘細胞體外培養(yǎng)取

10、卵后，機械法分離卵子周圍的卵丘顆粒細胞團，用0.1％透明質(zhì)酸酶消化并用吸管反復吹打直至將卵丘顆粒細胞團分散為單個細胞。按活細胞1×10<'4>/mL密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每瓶加1mL細胞懸液。加入含10％小牛血清的RPMI-1640液1mL后，在95％空氣、5％CO<,2>、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞貼壁后更換無血清RPMI-1640液，24小時后收集上清液。 3． LumiRex system(LumAvidin B

11、eads)檢測方法同第一部分【統(tǒng)計方法】 利用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，獨立樣本t檢驗比較妊娠組和非妊娠組組間因子水平的差異。方差分析分析卵巢反應組間因子表達量的差異，用偏相關分析各細胞因子表達量之間，細胞因子與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)和雌二醇之間的相關性。P=0.05差異有統(tǒng)計學意義。 【結果】 1．CC分泌的IL-1ra與成熟卵子數(shù)相關關系顯著，相關密切(P=0.05)；VEGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二

12、醇相關關系顯著，相關密切(P=0.05)。 2．根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同進行卵巢反應性分組，卵泡直徑為14mm以上的卵泡數(shù)≤3個為卵巢低反應組，卵泡數(shù)4～13個為卵巢中反應組，≥14個為卵巢高反應組。三組患者間年齡無差異(P>0.05)。VEGF在組間有顯著差異(P=0.05)，余因子水平未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 3．妊娠組與非妊娠組的年齡、獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇及孕酮均沒有差異(P>0.05)。兩組卵丘細胞

13、培養(yǎng)上清液中的9種細胞因子水平相近，均未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 【結論】 1．體外培養(yǎng)的人卵丘細胞分泌的IL-1ra水平與成熟卵子數(shù)相關，VEGF與卵子數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇正相關，IL-1ra和VEGF可能調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育成熟。 2．年齡相似的不同卵巢反應性組卵丘顆粒細胞的VEGF表達水平有顯著差異，而其它細胞因子未見差異，提示VEGF在卵巢對超促排卵的反應性中發(fā)揮了重要作用。 3．卵丘細胞分

14、泌的上述9種因子與臨床妊娠率無明顯關系，提示卵丘細胞表達的上述9種因子不影響IVF-ET的臨床妊娠率。 第三部分促性腺激素釋放激素激動劑對人卵巢壁層顆粒細胞多種細胞因子的調(diào)節(jié)作用 【研究目的】 研究在IVF-ET治療中使用促性腺激素釋放激素激動劑對人卵巢壁層顆粒細胞分泌的IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF的調(diào)節(jié)作用，探討GnRHa在IVF-ET中應用的安全性

15、。 【材料和方法】 1．壁層顆粒細胞標本同第一部分。 2．壁層顆粒細胞體外培養(yǎng)MGC培養(yǎng)24小時，觀察細胞貼壁后，更換無血清RPMI-1640液，促性腺激素激動劑(Gonadotrophinreleasing hormoneagonist，GnRHa)組為培養(yǎng)液中加入GnRHa，終濃度為100pg/ml。培養(yǎng)24h后，收集上清液。 3． Luminex system檢測同第一部分。 【統(tǒng)計方法】

16、 利用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，獨立樣本t檢驗比較GnRHa組和對照組間因子水平的差異。P≤0.05差異有統(tǒng)計學意義。 【結果】 比較加入GnRHa(實驗組)體外培養(yǎng)的MGC分泌上述細胞因子并與未加GnRHa(對照組)。兩組間的獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、妊娠率無明顯差異(p>0.05)。兩組間的上述9種細胞因子分泌水平無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。 【結論】 GnRHa對MGC表達IL-1α、I