順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對人卵巢顆粒細胞影響的比較研究.pdf

1、目的：卵巢惡性生殖細胞腫瘤(malignant ovarian germ cell tumors，MOGCTs)，是來源于原始生殖細胞的一組卵巢惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于上皮性腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年。因此保留生育功能的手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療顯得至關(guān)重要。多數(shù)惡性生殖細胞腫瘤對化療極其敏感，化療已成為非常重要的治療手段。但化療藥物可引起多種不良反應(yīng)，對多個器官系統(tǒng)造成損害，嚴重影響女性患者的生活質(zhì)量，尤其對因卵巢功能損害而導致的月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)、早

2、絕經(jīng)和不孕近年來日益得到學者們的關(guān)注。
　　 以不同濃度的順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素作用于人卵巢惡性生殖細胞腫瘤畸胎瘤細胞株P(guān)A-1，四甲基偶氮唑藍法(MTT)檢測順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對惡性畸胎瘤PA-1細胞株的半數(shù)致死量，以上述四種藥物的半數(shù)致死量作用于人卵巢顆粒細胞，探討順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對人卵巢顆粒細胞的生長及其功能的影響。
　　 方法：
　　 1、體外培養(yǎng)人卵巢

3、生殖細胞腫瘤畸胎瘤細胞株P(guān)A-1，將其按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10％的胎牛血清及青、鏈霉素(100U/ml)的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2、恒溫、飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25％的胰酶消化，制成單細胞懸液備用。
　　 2、將PA-1細胞株以細胞密度為6.5×104/孔接種于96孔板中，加入不同濃度的順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素，作用48h后，MTT比色法觀察其對PA-1細胞株的生長增殖作用，并測定

4、其半數(shù)致死量(IC50)。
　　 3、人卵巢顆粒細胞收集取自2010年3月～2010年11月期間在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的卵泡穿刺術(shù)患者，均為輸卵管不通或男性原因不孕的女性，月經(jīng)周期，排卵功能及內(nèi)分泌功能均正常。長周期方案超促排卵婦女，注射人絨毛膜促性腺激素34～36h后，在B型超聲引導下經(jīng)陰道取卵。
　　 4、體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細胞以對PA-1細胞株的半數(shù)致死量的順鉑、VP-

5、16、長春新堿、博來霉素作用于人卵巢顆粒細胞72h后，MTT比色法測定對顆粒細胞活性的影響，化學發(fā)光法測定顆粒細胞上清液雌激素水平，免疫細胞化學法觀察顆粒細胞Bcl-2/Bax表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對人卵巢惡性生殖細胞腫瘤畸胎瘤細胞株P(guān)A-1的影響
　　 1.1 PA-1細胞株的生長情況
　　 倒置相差顯微鏡下觀察，PA-1細胞株生長狀態(tài)良好，呈梭形，加入

6、化療藥物后，有些細胞由伸展開的梭形變?yōu)閳A形，隨著藥物濃度的增加，細胞膜開始皺縮，圓形細胞逐漸增多，細胞體積逐漸變小，形態(tài)不規(guī)則，細胞膜不再完整，細胞質(zhì)濃縮，細胞的貼壁能力降低，最后漂浮。
　　 1.2 MTT比色法檢測順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對PA-1細胞株的半數(shù)致死量
　　 不同濃度的順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素作用于PA-1細胞株48h后均出現(xiàn)隨著劑量的增大抑制作用增強，其半數(shù)致死量分別為順鉑0.

7、55mg/L，VP-161.67 mg/L，長春新堿1.8μg/L，博來霉素1.7 mg/L。
　　 2、對惡性畸胎瘤PA-1細胞株的半數(shù)致死量的順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素對人卵巢顆粒細胞的影響
　　 2.1人卵巢顆粒細胞體外生長情況
　　 經(jīng)苔盼藍染色，細胞成活率達90％以上。
　　 倒置相差顯微鏡下觀察，人卵巢顆粒細胞剛接種時細胞呈圓形，6h后貼壁，24h后貼壁達到90％以上，細胞形態(tài)規(guī)則呈

8、梭形，細胞核大，圓形，HE染色后細胞漿富含空泡及顆粒。細胞有聚集生長現(xiàn)象。
　　 2.2 MTT比色法檢測結(jié)果
　　 與空白對照組相比，順鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素組吸光度值均有所降低，除長春新堿組外均有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，組間比較，除VP-16與博來霉素組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外，各組間均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 2.3 E2水平檢測結(jié)果
　　 與空白對照組相比，順

9、鉑、VP-16、長春新堿、博來霉素組人卵巢顆粒細胞分泌E2水平均有所減少，除長春新堿組外，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，組間比較，除VP-16與博來霉素組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外，各組間均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 2.4免疫細胞化學法檢測Bcl-2/Bax結(jié)果
　　 光鏡下觀察Bcl-2/Bax定位于細胞漿，為棕黃色細密顆粒。本研究免疫細胞化學結(jié)果顯示，空白對照組和各處理組均有Bcl-2/Bax

10、表達。各組Bax表達較空白對照組有所增強，Bcl-2表達有所減弱。除長春新堿組外，各組與空白對照組相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、VP-16、博來霉素、順鉑、長春新堿作用于惡性畸胎瘤PA-1細胞株48h后均出現(xiàn)隨著劑量的增大而抑制作用逐漸增強。
　　 2、VP-16、博來霉素、順鉑、長春新堿作用于惡性畸胎瘤PA-1細胞株48h的半數(shù)致死量分別為VP-161.67 mg/L，博來霉素

11、1.7 mg/L，順鉑0.55mg/L，長春新堿1.8μg/L。
　　 3、對惡性畸胎瘤PA-1細胞株48h半數(shù)致死量的VP-16、博來霉素、順鉑對人卵巢顆粒細胞有顯著促凋亡作用，長春新堿促凋亡作用不明顯。
　　 4、對惡性畸胎瘤PA-1細胞株48h半數(shù)致死量的VP-16、博來霉素、順鉑作用于人卵巢顆粒細胞，使其分泌E2能力有所下降，而長春新堿對其分泌E2的影響不明顯。
　　 5、VP-16、博來霉素、順鉑、長春