RAPD技術對我國11株并殖吸蟲的遺傳變異初步探討.pdf

1、目的: 自1879年，Ringer在臺灣從一具葡萄牙水手尸體肺臟內首次檢出并殖吸蟲，至今人類研究已經有120多年的歷史。并殖吸蟲種類很多，世界各地報道達50多種（含種、亞種、變種和同種異名等），廣泛分布于東亞、東南亞、非洲和拉丁美洲等國家，在我國并殖吸蟲報道有30種之多（含種、亞種、變種和同種異名等），分布于全國各地，尤其在江南、西南和東北各省山區(qū)等地。并殖吸蟲種類命名存在如同種異名、種名錯定等諸多問題，主要與60年代以前單一以傳統(tǒng)形態(tài)

2、學為依據和60~80年代并殖吸蟲分類研究中的一點浮躁表現有關。因此澄清并殖吸蟲的分類學地位，不僅對充實與修訂并殖吸蟲分類學有理論意義，而且尚可為并殖吸蟲的臨床醫(yī)學、免疫學和流行病學監(jiān)控與制定防治策略提供參考。90年代以來，分子生物學技術廣泛應用于物種的遺傳變異和分類，直接從DNA水平反映基因本身，具有優(yōu)越性。因此，傳統(tǒng)分類學結合現代分子生物學方法分類是目前被普遍接受的一種分類方式。本實驗結合形態(tài)學觀察和RAPD技術對我國湖北、江西、浙江

3、等地的11株并殖吸蟲進行研究，以了解其遺傳變異情況，為并殖吸蟲分類提供依據，尤其對湖北省并殖吸蟲流行區(qū)劃分提供分子生物學依據。此外，探討采用不同蟲期標本（成蟲和囊蚴）及其不同保存方法(10％福爾馬林或-20℃冷藏)對該研究的影響。 材料與方法: 收集我國湖北省咸寧市溫泉區(qū)、江西省武寧縣、浙江省紹興蘭亭鄉(xiāng)、湖北省赤壁市趙李橋鎮(zhèn)、湖北省十堰市區(qū)、湖北省五峰縣、湖北省鶴峰縣五里鎮(zhèn)、湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)、湖北省神農架林區(qū)3省9地的11株并

4、殖吸蟲。其中湖北省咸寧市溫泉區(qū)、江西省武寧縣、浙江省紹興蘭亭鄉(xiāng)和湖北十堰市區(qū)4地的標本為成蟲，依地名分別稱：湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭、湖北十堰；其余5地標本為囊蚴，其中在五峰縣和鶴峰縣走馬鎮(zhèn)的同一淡水蟹發(fā)現有大小兩種囊蚴，依據大小分別稱五峰(a)、五峰(b)、走馬(a)、走馬(b)，余3株依地名分別稱：湖北赤壁、湖北五里、湖北神農架。 1.外形觀察：肉眼觀察成蟲外形，體視顯微鏡觀察囊蚴的形態(tài)并作記錄。 2. DNA提

5、?。翰扇〔煌椒ㄌ崛〔煌瑯吮净蚪MDNA。 3.RAPD-PCR技術：分別擴增上述并殖吸蟲的基因組DNA，根據擴增的結果，計算各株并殖吸蟲間的遺傳距離和相似系數，并采用SPSS11.0軟件的Between-groups linkage法對所得二元數據進行聚類分析，繪制系統(tǒng)進化樹。 結果: 1.外形觀察：成蟲湖北十堰株呈長梭形，湖北溫泉、江西武寧和浙江蘭亭等3株呈橢圓形；囊蚴呈圓形或類圓形，囊壁兩層，排泄囊內含黑色

6、顆粒，鑒定為并殖吸蟲囊蚴。其中湖北赤壁株內壁較厚；五峰(a)、五峰(b)、走馬(a)、走馬(b)和五里等5株內壁較?。缓鄙褶r架株，囊蚴形態(tài)因故已有些變形，但可以確定為并殖吸蟲囊蚴。 2.DNA提?。篋NA溶液A260/A280值經測定在1.60～2.00之間，純度符合要求。 3.RAPD-PCR：①各株間差異湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭和湖北赤壁4株遺傳距離在0.1034～0.1930；湖北走馬(a)、湖北走馬(b)、

7、湖北五峰(a)、湖北五峰(b)、湖北十堰和湖北五里等鄂西6株遺傳距離在0.1233～0.3000，其中湖北走馬2株擴增帶型具有較大相似性，相似系數為0.8182，遺傳距離為0.1818，湖北五峰2株擴增帶型也具有較大相似性，相似系數0.8767，遺傳距離僅為0.1233。湖北神農架株與各株遺傳距離在0.2329～0.4154，其與湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭和湖北赤壁4株遺傳距離在0.3333～0.4154，與余6株遺傳距離在0.232

8、9～0.3731。②系統(tǒng)進化樹在SPSS構建的系統(tǒng)進化樹中11株并殖吸蟲分為3類:江西武寧、浙江蘭亭、湖北溫泉和湖北赤壁等株為一類；湖北走馬(a)、湖北走馬(b)、湖北五峰(a)、湖北五峰(b)、湖北十堰和湖北五里等株為一類；湖北神農架株為另一類。 4.湖北省主要有兩個并殖吸蟲流行區(qū):以衛(wèi)氏并殖吸蟲為主的鄂東南區(qū)；以斯氏并殖吸蟲為主的鄂西區(qū)。 結論: 1.根據RAPD-PCR的實驗結果，3省11株并殖吸蟲在基因水