氟伐他汀對(duì)組織因子表達(dá)與RhoA-Rho激酶通路的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景:組織因子(TF)與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成之間的關(guān)系十分密切，他汀類藥物被證實(shí)具有抗炎、抗氧化及防止血栓形成等獨(dú)立于降脂以外的多效性，甲羥戊酸(MVA)是膽固醇合成的中間代謝產(chǎn)物，他汀類藥物是在競爭抑制膽固醇合成限速酶同時(shí)，間接抑制MVA途徑中的類異戊二烯等中間產(chǎn)物的合成，而這些中間產(chǎn)物是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞間復(fù)雜聯(lián)系的重要介質(zhì)，也是Rho等小G蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾過程中重要的脂質(zhì)附著分子。他汀類藥物對(duì)TF表達(dá)的影響如何?TF是否經(jīng)RhoA信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后促進(jìn)其表達(dá)?而他汀類對(duì)TF表達(dá)的影響是否受RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控?上述問題均不清楚。研究首先從臨床角度證實(shí)血漿TF水平對(duì)于急性心肌梗死(AMI)患者判斷近期臨床不良預(yù)后的重要意義，然后從TF活性、基因以及蛋白水平觀察不同濃度的氟伐他汀(Flu)對(duì)由腫瘤壞死因子-a(TNF-a)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)TF表達(dá)與RhoA活化的抑制作用，并從蛋白水平探討其可能的RhoA/Rho激酶通路的調(diào)控機(jī)制。

3、目的: 1.研究AMI患者血漿TF水平與C反應(yīng)蛋白(CRP)、心肌酶(CK-MB)、心功能(LVEF)及相關(guān)臨床事件等指標(biāo)之間的關(guān)系，探討血漿TF水平在預(yù)測AMI患者臨床不良預(yù)后方面的意義； 2.研究不同濃度Flu對(duì)由TNF-a誘導(dǎo)的HUVECs TF含量、活性及TFmRNA表達(dá)、TF蛋白水平的影響，探討他汀類藥物在抗血栓形成方面的作用； 3.研究RhoA/Rho激酶在氟伐他汀影響TF蛋白表達(dá)過程中的調(diào)控作用，探

4、討氟伐他汀在抗動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成作用的新靶點(diǎn)。 方法: 1.采用ELISA方法檢測AMI患者、穩(wěn)定型心絞痛(SAP)患者以及健康人血漿TF水平，依據(jù)血漿TF水平將AMI患者分為高TF組與低TF組，同時(shí)測定CRP、CK-MB、LVEF等指標(biāo)，隨訪30天，記錄主要心血管事件(心臟性猝死、充血性心力衰竭、非致命性再梗等)的發(fā)生率，以TF為自變量，對(duì)CRP、CK-MB、LVEF與主要心血管事件等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析； 2.

5、將同一簇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代后，分設(shè)對(duì)照組、TNF-a組、Flu組及干預(yù)組(TNF-a+Flu組)，其中TNF-a+Flu組中分別以不同濃度氟伐他汀(0.01，0.1，1，10，100μmol/L)干預(yù)，采用ELISA方法測定TF含量，用發(fā)色底物法測定TF活性，用RT-PCR方法測定TFmRNA表達(dá)水平，用Western-Blot方法測定TF蛋白表達(dá)和RhoA的活化水平；對(duì)照組、WNF-a+AngⅡ組、AngⅡ組、TNF-a

6、組、FNF-a+Y27632組五組HUVECs，采用Western-Blot方法測定TF蛋白表達(dá)水平； 3.以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。對(duì)主要統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。以上檢驗(yàn)均以P<0.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.SAP和AMI組患者TF水平較健康人明顯升高[(28.34±17.58)pg/ml vs(16.73±8.2

7、8)pg/ml；(42.76±25.14)pg/ml vs(16.73±8.28)pg/ml]，與SAP比較，AMI組患者TF水平亦明顯升高[(42.76±25.14)pg/ml vs(28.34±17.58)pg/ml]；在AMI患者中，高TF組主要心血管事件顯著高于低TF組(48.4％vs19.4％)，Logistic回歸分析表明，血漿TF水平與AMI患者心血管事件的發(fā)生呈正相關(guān)(OR為1.45)；與低TF組比較，高TF組患者CRP

8、[(12.7±5.9)mg/lvs(9.3±4.9)mg/l]、CK-MB[(84.4±30.2)U/Lvs(65.9±29.7)U/L]顯著升高，LVEF顯著降低[(34.9±11.4)％vs(51.9±8.9)％]，多元線性回歸分析顯示，TF與CRP(r=0.702)、CK-MB(r=0.519)呈正相關(guān)，與LVEF(r=-0.312)呈負(fù)相關(guān)； 2.TNF-a組TF含量[(9.64±0.58)pg/mlvs(2.30±0.

9、20)pg/ml]及TF活性[(32.56±3.12)pMvs(11.36±0.67)pM]、TFmRNA表達(dá)[(0.88±0.26)vs(0.02±0.01)]與TF蛋白水平[(0.94±0.32)vs(0.06±0.02)]較空白組均顯著增高；與TNF-a組比較，不同濃度氟伐他汀干預(yù)組TF含量與活性以及TFmRNA表達(dá)和TF蛋白水平均明顯降低，差異有顯著性；Flu的抑制作用呈濃度依賴性，F(xiàn)lu在濃度1μmol/L時(shí)可顯著抑制由TNF

10、-a誘導(dǎo)的TF水平及活性[(4.99±0.24)pg/mlvs(9.64±0.58)pg/ml，(20.27±1.26)pg/mlvs(32.56±3.12)pM]，繼續(xù)升高Flu濃度，作用無顯著差異。 3.TNF-a在誘導(dǎo)HUVECsTF表達(dá)的同時(shí)，可使RhoA活化，氟伐他汀可抑制RhoA活化；AngⅡ(RhoA激酶激動(dòng)劑)可促進(jìn)TNF-a誘導(dǎo)的HUVECsTF蛋白表達(dá)水平，而Y27632(RhoA激酶抑制劑)可抑制TNF-a

11、誘導(dǎo)的HUVECsTF蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論: 1.TF是參與動(dòng)脈粥樣硬化破裂斑塊血栓形成的關(guān)鍵因素，血漿TF水平的變化與AMI患者炎癥、病變范圍與嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，早期測定血漿TF可以作為AMI患者判斷未來心血管事件等不良預(yù)后的一個(gè)可行的預(yù)測因子； 2.氟伐他汀可有效抑制由TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TF含量、活性和基因以及蛋白表達(dá)水平，提示氟伐他汀具有潛在的降脂之外的抗動(dòng)脈血栓作用； 3.氟伐他汀對(duì)