RhoA-Rho激酶對高肺血流大鼠肺動脈高壓的作用.pdf

1、目的：高肺血流引起的肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是先天性心臟病的常見并發(fā)癥，往往伴有血管收縮性的增高和進(jìn)行性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，其發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。為了進(jìn)一步闡明肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)理，制作準(zhǔn)確可靠的動物模型是非常有必要的，為此，我們設(shè)計(jì)了一個簡單的方法建立高肺血流肺動脈高壓大鼠動物模型。 方法: 108只4周齡Wistar大鼠先行編號，計(jì)算機(jī)隨機(jī)分到4個分流組(每組15只)和4個對照

2、組(每組12只)，分流組大鼠通過套管連接法建立左側(cè)頸總動脈一頸外靜脈分流，對照組大鼠作假手術(shù)。分別在實(shí)驗(yàn)第1、2、4、8周，將3F導(dǎo)管在透視下沿右側(cè)頸靜脈插入右心室，多導(dǎo)生理記錄儀測量右心室收縮壓(RVSP)用以代替肺動脈收縮壓(PVSP)；分流通暢的大鼠均采集右心室、右側(cè)頸總動脈和頸外靜脈血液并作血?dú)夥治?，?jì)算Qp/Qs；分離、稱重并計(jì)算右心室壁與左心室壁加室間隔重量比[RV/(LV+SP)]、光鏡下觀察中等肺動脈形態(tài)改變、測量并計(jì)算

3、平均中膜厚度占管徑百分比(MT﹪)。免疫組化增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色分析平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增生情況。用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析PASMCs凋亡狀況。 套管連接頸總動脈一頸外靜脈引起肺循環(huán)血流量明顯增加、肺動脈收縮壓升高和以平滑肌細(xì)胞增殖增強(qiáng)和凋亡減弱為特征的肺血管重構(gòu)。這是一個簡單可靠的建立高肺血流狀態(tài)大鼠肺動脈高壓動物模型的方法。 結(jié)果: 高肺血流引起RVSP早期迅速升高和后期的進(jìn)行性升高

4、。與對照組相比，分流組RVSP在術(shù)后1周和8周顯著升高(分別為23.7±3.5 vs 12.8±2.6 mmHg，t=-8.799，p<0.01；27.1±6.7 vs14.3±3.1 mmHg， t=-5.332，P<0.01)。 與對照組相比，分流組以PASMCs過度增生和肥大為特征的中等肺動脈中膜增厚，術(shù)后第4周，中小肺動脈開始出現(xiàn)明顯的中膜增厚，表現(xiàn)為PASMCs明顯增生、排列紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞輕微增生、血管管腔顯著變小，M

5、T﹪與對照組相比顯著增大(28.2±4.8 vs 12.9±2.9，t=-9.192，P<0.01)。第8周，上述病理改變持續(xù)加重，PASMCs肥大、排列更紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞顯著增生、管腔不對稱、狹窄，非肌型小動脈嚴(yán)重肌化以至于管腔接近閉塞。MT﹪增加對照組的3.2倍(52.7±9.3 vs 16.4±3.2，t=-12.617，P<0.01)。長期高肺血流狀態(tài)可以引起右心室肥大，但是其形態(tài)改變出現(xiàn)較晚，與對照組相比，分流組在術(shù)后8周才有R

6、V/(LV+SP)的顯著升高(36.3±3.2 vs 31.2±4.1，t=-3.157，P<0.01)。與對照組相比，分流組PCNA-陽性平滑肌細(xì)胞在第1周顯著升高(9.7+2.5 vs7.5±2.1，t=-2.438，P<0.05)到第2周達(dá)最高值(15.8±2.9 vs 8.4±2.5，t=-7.213，P<0.01)，然后，到第4周開始下降，但仍然顯著高于對照組(9.8±2.5v 結(jié)論: 高肺血流所致的大鼠肺血管

7、早期急性收縮和和后期的結(jié)構(gòu)重構(gòu)與RhoA/Rho激酶的mRNA、蛋白表達(dá)和活性增強(qiáng)有關(guān)。 本研究的目的在于進(jìn)一步揭示RhoA/Rho激酶在高血肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制中所起的作用，以及Rho激酶抑制劑一法舒地爾能否有效改善高肺血流引起的肺動脈高壓。 方法: 168只4周齡wistar大鼠先行編號，計(jì)算機(jī)隨機(jī)分到4個分流組(每組15只)和4個對照組(每組12只)，分流組大鼠通過套管連接法建立左側(cè)頸總動脈-頸外靜脈分流，對

8、照組大鼠作假手術(shù)。治療組大鼠腹腔注射法舒地爾30mg/kg/d，其余大鼠注射同等量的生理鹽水。分別在實(shí)驗(yàn)第1、2、4、8周，將3F導(dǎo)管在透視下沿右側(cè)頸靜脈插入右心室，多導(dǎo)生理記錄儀測量右心室收縮壓(RVSP)代替肺動脈收縮壓(PVSP)；分流通暢的大鼠均采集右心室、右側(cè)頸總動脈和頸外靜脈血液并作血?dú)夥治?，?jì)算Qp/Qs；分離、稱重并計(jì)算右心室壁與左心室壁加室間隔重量比RV/(Lv+SP)、光鏡下觀察中等肺動脈中膜平滑肌形態(tài)改變、測量并計(jì)

9、算平均中膜厚度占管徑百分比(MT﹪)。免疫組化增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色分析平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增生情況。用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析PASMCs凋亡狀況。用pull down assay分析RhoA活性。 結(jié)果: 法舒地爾能夠有效抑制RVSP的升高，與對照組相比，分流組RVSP在術(shù)后1周和8周出現(xiàn)顯著升高(分別為23.7±3.5 vs 12.8±2.6 mmHg，P<0.01；27.1±6.7vs14.

10、3±3.1 mmHg，P<0.01)。治療組僅在術(shù)后8周RVSP高于對照組(19.4±3.3 vs14.3±3.1 mmHg，P<0.05)，但仍顯著低于分流組(19.4±3.3 vs 27.1±6.7 mmHg，P<0.01)。法舒地爾也能有效抑制肺動脈結(jié)構(gòu)重構(gòu)和右心室肥大，術(shù)后第4周，肺動脈開始出現(xiàn)明顯的中膜增厚，表現(xiàn)為PASMCs明顯增生、排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞輕微增生，管腔變小，MT﹪與對照組相比顯著增大(28.2±4.8 vs 1

11、2.9±2.9，P<0.01)。第8周，上述病理改變持續(xù)加重，PASMCs肥大、排列更紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞增生，管腔不對稱、狹窄，大部分肺小動脈50﹪以上管腔阻塞。MT﹪增加到對照組的3.2倍(52.7±9.3 vs 16.4±3.2，P<0.01)。僅在術(shù)后第8周，治療組出現(xiàn)較明顯的肺動脈中膜PASMCs增生、排列紊亂，MT﹪明顯高于對照組(31.2±3.5 vs 16.4±3.2，P<0.01)，但是仍顯著低于分流組(31.2±3.5 v

12、s 52.7±9.3，P<0.01)。右心室壁的改變出現(xiàn)較晚，與對照組相比，分流組在術(shù)后8周才有RV/(LV+SP)的顯著升高(0.363±0.032 vs 0.312±0.041，P<0.01)，治療組無變化(0.323±0.047vs 0.312±0.041，P>0.05)。 MYPT1磷酸化程度檢測提示法舒地爾能夠高效抑制Rho激酶活性，與對照組相比，術(shù)后1周MYPT1磷酸化程度即出現(xiàn)明顯增加(2.78±0.35倍高于對照

13、組，P<0.01)，第4周達(dá)高峰(3.63±0.52倍高于對照組，P<0.01)。第8周明顯下降，但是仍顯著高于對照組(2.36±0.39倍高于對照組，P<0.01)。而治療組MYPT1磷酸化程度在各時間點(diǎn)均顯著低于分流組。 高肺血流狀態(tài)使肺血管平滑肌細(xì)胞增生活性增加，法舒地爾治療能夠有效抑制平滑肌細(xì)胞增生。在高肺血流影響下，與對照組相比，分流組PCNA-陽性平滑肌細(xì)胞在第l周顯著升高(9.7±2.5 vs 7.5±2.1，tr

14、=-2.438，P<0.05)到第2周達(dá)最高值(15.8±2.9 vs 8.4±2.5，t=-7.213，P<0.01)，然后，到第4周開始下降，但仍然顯著高于對照組(9.8±2.5 vs 7.2±1.9，t=-2.711，P<0.05)，到第8周與對照組無明顯差異(5.7±1.6 vs 7.1±1.6，t=1.925，P>0.05)。相比而言，法舒地爾治療組PCNA-陽性平滑肌細(xì)胞百分比在第1、2、4周均顯著低于分流組(分別為7.9±

15、1.5 vs 9.7±2.5，P=0.03：10.5±2.9 vs 15.8±2.8，P<0.01：5.9±1.9 vs 9.8±2.5，P<0.01)。 高肺血流狀態(tài)下，PASMCs凋亡進(jìn)行性減弱，與對照組相比，TUNEL-陽性細(xì)胞百分比在第2周顯著下降(0.61±0.21 vs 0.84±0.27，P<0.05)，到第8周時已經(jīng)很少見到TUNEL-陽性PASMCs(0.21±0.17 vs 0.62±0.22，P<0.01)