一體化關(guān)節(jié)軟骨-骨復(fù)合修復(fù)材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上的常見(jiàn)病，由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血液循環(huán)和神經(jīng)支配，其自行修復(fù)能力有限。骨軟骨聯(lián)合缺損常影響到關(guān)節(jié)的機(jī)械穩(wěn)定性，從而增加骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險(xiǎn)。因此，研究開(kāi)發(fā)合適的骨軟骨移植替代材料具有廣泛的現(xiàn)實(shí)意義。本研究從以下幾個(gè)方面對(duì)一種新型骨軟骨一體化移植修復(fù)材料進(jìn)行了探索，材料的一體化設(shè)計(jì)可有效解決移植物的軟骨與骨部分的整合問(wèn)題，同時(shí)材料的分層結(jié)構(gòu)又分別適合相應(yīng)的軟骨或骨組織的生長(zhǎng)分化。
　　1.膠原/殼聚糖/納米TCP一體

2、化骨軟骨層狀修復(fù)體的孔隙結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性研究
　　目的：對(duì)膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)體作為組織工程支架材料的孔隙結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。
　　方法：以膠原、殼聚糖、納米TCP為基本材料，通過(guò)無(wú)毒交聯(lián)和冷凍干燥方法制備膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)體。以體積法測(cè)定支架材料的孔隙率，掃描電鏡觀察材料的孔隙結(jié)構(gòu)及孔徑大小。原代培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSC），傳至第二代后以3.0×105個(gè)/m

3、l的細(xì)胞濃度接種于材料，MTT法于接種后2、4、6、9、12d測(cè)細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)曲線。2w后掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的粘附情況。
　　結(jié)果：通過(guò)體積法測(cè)定材料的孔隙率為95％，SEM可以觀察到支架材料具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙結(jié)構(gòu)規(guī)則，孔徑100～150μm，材料內(nèi)部孔與孔之間貫通良好；納米TCP被包裹在修復(fù)體表面，兩者結(jié)合緊密，顆粒分布較為均勻。MSC在材料上增殖迅速，細(xì)胞基本呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)。SEM顯示MSC在材料上經(jīng)三維培養(yǎng)1

4、4d后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞成片地粘附于支架表面及孔隙側(cè)壁,并可見(jiàn)細(xì)胞間通過(guò)突起相互連接成片。
　　結(jié)論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙率，細(xì)胞在材料上能夠很好的粘附和生長(zhǎng)，并且增殖迅速，有望成為一種新型組織工程支架材料。
　　2.膠原/聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)體的體外三維軟骨誘導(dǎo)和異位成軟骨實(shí)驗(yàn)
　　目的：探索膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)材料接種MSC

5、后體外三維成軟骨誘導(dǎo)的可行性。
　　方法：2月齡日本大耳白兔8只，分別抽取其雙側(cè)頸骨平臺(tái)下方骨髓，密度梯度離心法分離MSC，原代培養(yǎng)。待細(xì)胞傳至第二代，以2×106個(gè)/ml的濃度接種于支架材料，24孔板內(nèi)培養(yǎng)，隨即培養(yǎng)液更換為含rhTGFβ110μg/L、地塞米松1×107mol/L、VitC50μg/L、新生牛血清100mL/L的軟骨誘導(dǎo)液。2w后取材料-細(xì)胞復(fù)合物切片，HE、甲苯胺蘭染色觀察材料內(nèi)部的細(xì)胞生長(zhǎng)情況和誘導(dǎo)分化情況

6、；其余材料自體回植于兔股部肌袋。6w后取材，HE染色、甲苯胺蘭染色、II型膠原免疫組化染色進(jìn)一步鑒定細(xì)胞在體內(nèi)的分化效果。
　　結(jié)果：MSC在體外三維軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中增殖迅速，切片染色可見(jiàn)細(xì)胞呈多層覆蓋于材料表面及內(nèi)部孔壁，部分細(xì)胞生長(zhǎng)成團(tuán)，甲苯胺蘭染色可見(jiàn)材料內(nèi)的細(xì)胞大部分呈現(xiàn)陽(yáng)性，支架材料部分降解，但總體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。經(jīng)體外誘導(dǎo)2w后的細(xì)胞/材料復(fù)合物自體肌袋埋植6w后，可見(jiàn)支架材料大部分降解，軟骨樣組織在材料內(nèi)部形成，甲

7、苯胺蘭和免疫組化染色均呈現(xiàn)陽(yáng)性。
　　結(jié)論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)材料接種MSC后可被三維誘導(dǎo)向軟骨分化，并保持旺盛的增殖能力。經(jīng)誘導(dǎo)2w的細(xì)胞材料復(fù)合物植入自體骨部肌袋后，能進(jìn)一步向軟骨方向分化。
　　3.復(fù)合bBMP骨軟骨修復(fù)材料的研制
　　目的：將具有高效成骨、成軟骨活性的牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bBMP）復(fù)合入材料當(dāng)中，以增強(qiáng)材料的生物活性。
　　方法：稱取bBMP40mg，溶于4ml4M

8、鹽酸胍。將膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)體浸泡于bBMP溶液中，排盡材料內(nèi)部氣泡。將充分吸附bBMP溶液的材料打包于透析膜內(nèi)，對(duì)蒸餾水透析4d，而后冷凍干燥12h，環(huán)氧乙烷消毒備用。取3塊復(fù)合bBMP的材料噴金后行掃描電鏡觀察。取6塊復(fù)合bBMP的材料以1×106個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種兔MSC，2w后掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的粘附和生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：材料復(fù)合bBMP后大體形狀及孔隙結(jié)構(gòu)與復(fù)合前無(wú)異，掃描電鏡可以清

9、楚觀察到材料表面及孔隙內(nèi)部有絲絮狀bBMP薄膜，MSC在生物材料上生長(zhǎng)迅速，黏附良好，材料的表面及孔隙內(nèi)部均有大量MSC生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：應(yīng)用透析方法制備的生物材料保持了良好的結(jié)構(gòu)，具有良好的細(xì)胞相容性，同時(shí)理論上將大大提高材料的生物學(xué)性能。
　　4.復(fù)合bBMP骨軟骨修復(fù)材料用于兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)的初步研究
　　目的：以復(fù)合bBMP的生物活性材料修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，驗(yàn)證材料的生物活性。
　　方法：2.5±0.

10、2kg體重日本大耳白兔8只，在雙側(cè)股骨髁間窩處制造直4mm深達(dá)髓腔下的缺損。將8塊復(fù)合bBMP的骨軟骨修復(fù)材料分別植入右側(cè)缺損作為實(shí)驗(yàn)組，4塊不含bBMP的膠原/殼聚糖/納米TCP一體化層狀修復(fù)體植入左側(cè)缺損作為對(duì)照組1，其余4個(gè)左側(cè)缺損曠置作為對(duì)照組2。12周后取材，大體觀察及切片染色觀察缺損修復(fù)情況。
　　結(jié)果：12周后，實(shí)驗(yàn)組骨軟骨缺損被白色透明組織覆蓋，與周圍軟骨連接緊密，已無(wú)明顯分界線；對(duì)照1骨軟骨缺損內(nèi)為白色纖維樣組織

11、填充，缺損輪廓依然明顯；對(duì)照2缺損依然較深，中心僅少量組織填充。鏡下實(shí)驗(yàn)側(cè)HE染色顯示透明軟骨形態(tài)，甲苯胺蘭染色顯示新生組織軟骨表型明顯，軟骨下骨修復(fù)良好；對(duì)照1缺損表面以纖維樣組織修復(fù)，軟骨下骨已經(jīng)基本修復(fù)；對(duì)照2仍有較深的缺損，缺損頂部覆以纖維樣組織。
　　結(jié)論：膠原/殼聚糖/納米TCP一體化骨軟骨層狀修復(fù)體復(fù)合bBMP后具有較強(qiáng)的生物活性，能在早期較好的修復(fù)骨軟骨聯(lián)合缺損。
　　以上研究結(jié)果表明，膠原/殼聚糖/納米TC