高速逆流色譜大規(guī)模純化和厚樸酚及應(yīng)用SILAC技術(shù)研究和厚樸酚治療HepG2細(xì)胞作用機(jī)理.pdf

1、和厚樸酚是中藥厚樸的主要化學(xué)成分。據(jù)報(bào)道：和厚樸酚具有多途徑抗腫瘤機(jī)制，如誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與分化，引起細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與上調(diào)促凋亡因子Bid、下調(diào)抑凋亡因子Bcl-XL，以及激活p53非依賴(lài)、線(xiàn)粒體依賴(lài)的Caspase通路有關(guān)。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要，我們需要找到一種高效快速的分離技術(shù)純化出大量的和厚樸酚，高速逆流色譜儀是一種液液分離裝置，經(jīng)過(guò)多年的改進(jìn)，發(fā)展為一種快速的分離技術(shù)，可以和高效液相色譜媲美，是一種分離天然藥物的理想的設(shè)備。SILAC

2、技術(shù)：即是用同位素標(biāo)記必需氨基酸，將它加到缺乏此氨基酸的培養(yǎng)基，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞代謝，標(biāo)記的氨基酸融合到蛋白中，形成內(nèi)碼子。它與質(zhì)譜結(jié)合，為定量蛋白組提供了和好的技術(shù)。本文旨在用高速逆流色譜從植物厚樸中大規(guī)模分離和厚樸酚，并利用SILAC技術(shù)，將和厚樸酚治療同位素標(biāo)記的肝癌細(xì)胞HepG2，通過(guò)質(zhì)譜鑒定，用定量蛋白組的方法鑒定出和厚樸酚引起的蛋白調(diào)控，從而確定出和厚樸酚抗腫瘤的作用機(jī)理。 方法：使用英國(guó)布魯內(nèi)爾提供的分

3、析型HSCCC優(yōu)化分離的條件，包括流速、進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣量。并將優(yōu)化的條件放大到制備型HSCCC。大規(guī)模分離純化出和厚樸酚。用和厚樸酚治療經(jīng)亮氨酸--d3完全標(biāo)記的肝癌細(xì)胞HepG2，提取蛋白，利用質(zhì)譜檢測(cè)總蛋白，以保守蛋白β--actine為標(biāo)準(zhǔn)，確定出和厚樸酚引起調(diào)控的蛋白。推斷出和厚樸酚抗腫瘤作用機(jī)理。 結(jié)果：經(jīng)分析型HSCC優(yōu)化，逆流色譜分離的條件為：轉(zhuǎn)速為每分鐘1800轉(zhuǎn)；流速為每分鐘2.5毫升；進(jìn)樣量為分離柱的5％；進(jìn)

4、樣濃度為每毫升80毫克。這些優(yōu)化的條件成功的運(yùn)用到制備型高速逆流色譜。在大規(guī)模分離純化和厚樸酚與厚樸酚中，我們用三種不同的濃度(20mg/ml，75mg/ml，250mg/ml)進(jìn)樣，從59.2克粗品中分離出純度高達(dá)99.9％的厚樸酚24.7克與純度高達(dá)98.6％的和厚樸酚23.2克。我們用10 μ g/ml濃度和厚樸酚作用HepG2細(xì)胞24h。通過(guò)質(zhì)譜鑒定了290個(gè)蛋白，其中和厚樸酚引起蛋白上調(diào)占了5.5％，下調(diào)蛋白占了72.4％；與

5、細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白有23個(gè)。 結(jié)論：本文中，我們成功利用了HSCCC大規(guī)模純化和厚樸酚。采用SILAC技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)了和厚樸酚引起的蛋白調(diào)控，其中在與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白中，我們選擇 Ras GTPase-activating-like protein IQGAPl(p195)與 94kDaglucose-regulated protein(GRP94)進(jìn)行PCR與Westen-blot驗(yàn)證。證實(shí)了和厚樸酚可能通過(guò)引起一系列的蛋白