銅綠假單胞菌噬菌體、QS系統(tǒng)與生物被膜的相關(guān)研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又稱為綠膿桿菌，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和對(duì)多種抗生素的耐受能力。對(duì)于人體而言，銅綠假單胞菌是最重要的條件致病菌之一，它常常引起創(chuàng)傷、燒傷及免疫受損機(jī)體嚴(yán)重的感染，危害人類的健康與生命。在銅綠假單胞菌中噬菌體研究、QS(Quorum Sensing)系統(tǒng)研究和生物被膜研究已經(jīng)成為當(dāng)前熱點(diǎn)。 本研究包括以下三部分內(nèi)容： 1、銅綠假單胞菌噬菌體的分離以及生物學(xué)特性研

2、究 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心污水中分離到一株銅綠假單胞菌溶原性噬菌體，該噬菌體的宿主為一株臨床分離的環(huán)丙沙星耐藥株P(guān)A0315(MIC64mg／L)。電鏡照片顯示該噬菌體大小約為230nm， 具有典型的復(fù)合體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，屬肌尾噬菌體科，命名為PPA5。根據(jù)DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PPA5為溶原性噬菌體，最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1。PPA5感染宿主的潛伏期為1.5h，裂解期為2.0h，裂解量為31。限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果顯示，噬菌

3、體DNA為環(huán)狀dsDNA，其基因組大小約為35kb—45kb。PPA5在自然條件下組成型表達(dá)約10多種蛋白，包括各種結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。這些數(shù)據(jù)為下一步研究噬菌體的序列以及噬菌體與宿主菌的生理關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 2、銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的研究 LasR和RhlR是QS系統(tǒng)(Quorum-Sensing)中極為重要的分子，它們可以分別與高絲氨酸內(nèi)酯結(jié)合，產(chǎn)生有功能的信號(hào)分子。我們以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AOl的基因組DNA為模

4、板，PCR方法擴(kuò)增lasR和rhlR基因。利用pGEX4T-1載體構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)包涵體提取純化后得到較純的融合蛋白。同時(shí)，構(gòu)建lasR／pcDNA3.1(+)、lasR／pEGFP-C1、rhlR／pcDNA3.1(+)和rhlR／pEGFP-C1的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。用這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HK293細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)LasR和RhlR均能夠

5、在真核細(xì)胞中表達(dá)。重組質(zhì)粒免疫小鼠后，用ELISA的方法可以從小鼠血清中檢測出陽性抗體。 3、銅綠假單胞菌噬菌體、QS系統(tǒng)與生物被膜的關(guān)系研究 在噬菌體溶原化菌株P(guān)A0317中檢測lasR和rhlR的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)9-12h時(shí)兩基因的表達(dá)量比對(duì)照組高出4-5倍。用硅膠膜培養(yǎng)法測定LasR蛋白和RhlR蛋白對(duì)生物被膜形成的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白在體外模型中能夠加快銅綠假單胞菌生物被膜的形成速度。同時(shí)用純化的重組蛋白免疫