鐵離子對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：本課題通過對(duì)銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1、菌毛突變株P(guān)AO-ApilHIJK以及密度感知(quorum sensing，QS)系統(tǒng)las扣rh1基因缺失的雙變異株P(guān)AO-JP2的生物學(xué)特性研究，比較缺鐵與正常環(huán)境對(duì)銅綠假單胞菌耐藥性、生物被膜形成能力、毒力因子表達(dá)等的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用菌落形態(tài)觀察、Gram's染色鏡檢、β-內(nèi)酰胺酶鑒定、VITEK全自動(dòng)微生物分析儀鑒定、原子力顯微鏡觀察等方法對(duì)P

2、AO1、PAO-△pilHIJK和PAO-JP2生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定比較；采用2，2'-聯(lián)吡啶(DPD)為螯合劑建立體外缺鐵環(huán)境模型；應(yīng)用瓊脂平板稀釋法測(cè)定頭孢他定、妥布霉素和環(huán)丙沙星3種抗菌藥物在正常與缺鐵環(huán)境下對(duì)菌株的MIC值；應(yīng)用微量稀釋法測(cè)定正常與缺鐵環(huán)境下對(duì)菌株的MBEC值；應(yīng)用MTT法測(cè)定正常與缺鐵環(huán)境下3種抗菌藥物對(duì)生物被膜內(nèi)菌的殺菌活性；應(yīng)用銀染后光鏡、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察在正常與缺鐵環(huán)境中培養(yǎng)7日后PAO1、P

3、AO-ΔpilHIJK和PAO-JP2生物被膜結(jié)構(gòu)，并采用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)對(duì)銀染后的硅膠片生物被膜圖像進(jìn)行分析。應(yīng)用針眼法測(cè)定不同鐵離子環(huán)境對(duì)3株菌蹭行能力的影響；應(yīng)用及酶-底物反應(yīng)法觀察鐵離子對(duì)3株菌彈性蛋白酶的影響；應(yīng)用SDS-PAGE方法觀察鐵離子對(duì)3株菌外毒素A的影響；利用熒光定量PCR定量分析缺鐵環(huán)境對(duì)PAO1、PAO-ΔpilHIJK菌株lasR和rh1R基因轉(zhuǎn)錄影響。 結(jié)果：PAO1菌落可見明顯的膿綠素，而PAO

4、-ΔpilHIJK和PAO-JP2未見；3株菌均為β-內(nèi)酰胺酶陰性的革蘭陰性桿菌；VITEK鑒定發(fā)現(xiàn)PAO1、PAO-ΔpilHIJK、PAO-JP2及ATCC27853標(biāo)準(zhǔn)株在細(xì)菌生化反應(yīng)上存在細(xì)微的差異，但均鑒定為銅綠假單胞菌。原子力顯微鏡觀察3株菌均為短桿狀，從長(zhǎng)度來比較，PAO1＞PAO-ApilHIJK＞PAO-JP2。DPD體外抑菌濃度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPD為500μM時(shí)對(duì)3株菌的正常生長(zhǎng)未有影響。MIC結(jié)果顯示，缺鐵時(shí)浮游菌對(duì)藥物

5、的敏感性輕微下降。MBEC結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妥布霉素在8MIC時(shí)，能夠完全殺死被膜中菌；而頭孢他定和環(huán)丙沙星在8MIC時(shí)無該效果．MTT法研究發(fā)現(xiàn)缺鐵環(huán)境能夠促進(jìn)藥物的殺被膜內(nèi)菌的活性。銀染法的圖片和計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果展示了在缺鐵環(huán)境中，PAO1、PAO-ΔpilHIJK和PAO-JP2形成的黑染交織物均顯著減少；SEM結(jié)果顯示，7日正常環(huán)境培養(yǎng)后PAO1形成成熟生物被膜，而在缺鐵狀態(tài)下只能形成散在小菌團(tuán)；PAO-ΔpilHIJK在正常環(huán)境中呈

6、多數(shù)小團(tuán)塊聚集狀，但結(jié)構(gòu)沒有PAO1致密；缺鐵時(shí)同PAO1類似，偶見散在小菌團(tuán)。PAO-JP2正常情況下形成的被膜結(jié)構(gòu)就很不典型，菌團(tuán)小且稀疏、散在的細(xì)菌多；缺鐵時(shí)僅可觀察到少量單個(gè)菌體黏附在硅膠膜表面。CSLM觀察發(fā)現(xiàn)PAO1形成的生物被膜為大塊狀隆起，而PAO-ΔpilHIJK表面為大量的小隆起；在缺鐵情況下，PAO1的被膜仍呈片狀分布，亮度和面積都明顯減少，PAO-ΔpilHIJK則呈稀疏點(diǎn)狀分布。蹭行能力考察發(fā)現(xiàn)缺鐵環(huán)境能顯著刺

7、激具有Ⅳ型菌毛的PAO1和PAO-JP2蹭行運(yùn)動(dòng)活性，而適當(dāng)加入鐵離子能抵消該作用；對(duì)喪失了蹭行能力的菌毛突變株P(guān)AO-ΔpilHIJK的影響不大。在缺鐵時(shí)PAO1和PAO-ΔpilHIJK彈性蛋白酶的表達(dá)量會(huì)顯著增加，加入鐵后部分恢復(fù)；鐵濃度幾乎對(duì)原本表達(dá)已經(jīng)很少的PAO-JP2菌株的影響很小。缺鐵環(huán)境是PAO1和PAO-ΔpilHIJK表達(dá)的外毒素A的必要條件；PAO-JP2則在任何情況下都沒有外毒素A的表達(dá)。缺鐵時(shí)PAO1菌株la