龍芩草、通絡(luò)救腦組方成分的藥學(xué)、藥效學(xué)及作用機(jī)制.pdf

1、1目的現(xiàn)代中藥制劑應(yīng)具有“三效(高效、速效、長(zhǎng)效)”、“三小(劑量小、毒性小、副作用小)”、“五方便(儲(chǔ)存、運(yùn)輸、服用、攜帶和生產(chǎn)方便)”的優(yōu)點(diǎn)，并且安全、有效、可控、穩(wěn)定。本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，將中藥地龍、黃芩、甘草；梔子、三七進(jìn)行有效部位提取，分別精制而成龍芩草噴霧劑、龍芩草口含片和通絡(luò)救腦注射液、通絡(luò)救腦口服微乳等現(xiàn)代劑型。通過藥學(xué)、藥效學(xué)及其相關(guān)作用機(jī)制的研究，成分基本明確、藥效可以肯定、質(zhì)量能夠控制，進(jìn)而確定合理的制劑工藝

2、，建立科學(xué)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。并通過口、鼻腔粘膜給藥(龍芩草噴霧劑、口含片)和運(yùn)用納米級(jí)微乳載藥體系口服給藥(通絡(luò)救腦口服微乳)，提高生物利用度，增進(jìn)療效。 2方法 研究?jī)?nèi)容主要包括龍芩草噴霧劑、口含片的制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定性、主要藥效學(xué)、家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)等：通絡(luò)救腦口服微乳制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定性、家兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定。 龍芩草組方部分：龍芩草組方由地龍、黃芩、甘草組成，結(jié)合病毒感染所致的流感，上

3、呼吸道感染等癥特點(diǎn)，遵循中醫(yī)藥理論配伍規(guī)律，經(jīng)藥理學(xué)篩選得到最佳處方，運(yùn)用現(xiàn)代制藥新技術(shù)，經(jīng)高效提取分離有效部位制成經(jīng)口、鼻腔粘膜給藥制劑，具有清肺利咽，解毒瀉熱之功效。 (1)龍芩草噴霧劑、口含片制備工藝：地龍采用生物化學(xué)方法提取有效成分；黃芩依《中國(guó)藥典》2005年版一部黃芩提取物項(xiàng)下要求、甘草依國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001(HD1269)-2002項(xiàng)下甘草酸單銨鹽有關(guān)規(guī)定，用HPLC方法控制黃芩苷和甘草酸單銨鹽含量；依照噴

4、霧劑、口含片的制劑要求確定各步參數(shù)，從而確定制備工藝。(2)龍芩草噴霧劑、口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：采用薄層色譜法對(duì)方中黃芩、甘草、地龍進(jìn)行定性鑒別，用HPLC方法對(duì)方中黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，確定制劑黃芩苷含量限度；并按《中國(guó)藥典》附錄制劑通則口服液、口含片項(xiàng)下規(guī)定制定檢查項(xiàng)目。 (3)龍芩草制劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：用留樣觀察方法、按擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，檢查各項(xiàng)。 (4)龍芩草噴霧劑、口含片藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)：采用大腸桿菌內(nèi)毒素致日本大耳白家兔發(fā)熱模

5、型，觀察龍芩草制劑的解熱作用及其對(duì)TNF-α的影響；用小鼠氨水引咳法，觀察龍芩草制劑對(duì)模型小鼠的鎮(zhèn)咳功效；采用油酸致大鼠急性肺損傷模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，觀察龍芩草噴霧劑對(duì)大鼠肺組織內(nèi)TNF、IL-6、IL-2等炎性因子的表達(dá)的影響；采用流感病毒A1型(H1N1)鼠肺適應(yīng)株FM-1致小鼠感染，測(cè)得LD50;測(cè)得龍芩草小鼠的最大耐受量；以小鼠死亡率、保護(hù)率、平均生活日及延長(zhǎng)生命率為指標(biāo)，測(cè)得龍芩草噴霧劑對(duì)流感病毒致小鼠死亡的保護(hù)作用。

6、 (5)龍芩草噴霧劑家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)采用家兔經(jīng)口、鼻腔粘膜給藥與口服給藥，分別在不同時(shí)間取血，測(cè)得相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，比較二給藥途徑的血藥濃度，計(jì)算相對(duì)生物利用度；經(jīng)霧化給藥，剝離家兔口、鼻腔粘膜，測(cè)定粘膜內(nèi)含藥。 (6)龍芩草噴霧劑、口含片毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)：按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》方法，對(duì)龍芩草制劑粘膜毒性、急性毒性、長(zhǎng)期毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察各項(xiàng)指標(biāo)及制作病理切片。 通絡(luò)救腦組方部分：通絡(luò)救腦處方由梔子、三七

7、兩味中藥組成，結(jié)合近年來有關(guān)腦缺血病理過程及相關(guān)藥物的研究結(jié)果，遵循中醫(yī)藥理論配伍規(guī)律，經(jīng)藥理學(xué)篩選得到最佳處方，運(yùn)用現(xiàn)代制藥新技術(shù)，經(jīng)高效提取分離有效部位制成注射劑、口服微乳，具有涼血解毒、化瘀通絡(luò)之功效。通絡(luò)救腦注射劑我們?cè)?003年臨床前工作已完成，正在臨床試驗(yàn)后期，已經(jīng)形成碩士論文，本論文不再重述實(shí)驗(yàn)過程。 (7)通絡(luò)腦口服微乳制備工藝實(shí)驗(yàn)：方中梔子運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳提取工藝，用活性炭分離精制，得到梔子提取物；用H

8、PLC儀梯度洗脫，測(cè)得三七總皂苷主要有效成分；采用三點(diǎn)相圖法，優(yōu)化空微乳液的最佳比例。 (8)通絡(luò)救腦口服微乳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)：采用薄層色譜鑒別梔子、三七；運(yùn)用HPLC方法測(cè)定梔子苷含量；按中國(guó)藥典2005年版附錄口服液要求，確定各參數(shù)。 (9)絡(luò)救腦穩(wěn)口服微乳定性實(shí)驗(yàn)：用留樣觀察法，按擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目考核。 (10)通絡(luò)救腦口服微乳家兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定：以人參皂苷Rg1為指標(biāo)，家兔口服人參皂苷Rg1微乳液、水溶液

9、，與耳緣靜脈注射血栓通注射液相比較，測(cè)得口服微乳的生物利用度。 3結(jié)果 龍芩草部分： (1)龍芩草噴霧劑、口含片制備工藝：用生物化學(xué)方法提取地龍有效成分，保證地龍中各種酶的活性；檢測(cè)得到黃芩提取物中黃芩苷含量85.5％、甘草提取物中甘草酸單銨鹽含量75％，均符合規(guī)定。根據(jù)各藥性質(zhì)確定制備工藝，并經(jīng)中試規(guī)模樣品生產(chǎn)，結(jié)果工藝參數(shù)穩(wěn)定，制備的噴霧劑、口含片符合規(guī)定。 (2)龍芩草噴霧劑、口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：確定了

10、薄層色譜方法；規(guī)定了檢查項(xiàng)目；制定了制劑黃芩苷含量限度，每25ml樣品黃芩苷含量不低于100mg，實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察均符合要求。 (3)龍芩草噴霧劑、口含片初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)室留樣觀察三月，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目檢查，包括外觀、鑒別、檢查、含量測(cè)定、衛(wèi)生學(xué)，均符合規(guī)定。 (4)龍芩草噴霧劑、口含片藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)：對(duì)于脂多糖致家兔發(fā)熱模型有顯著的解熱作用(P＜0.01)，且劑量增大時(shí)作用增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)顯示脂多糖可刺激ATⅡ細(xì)胞分泌TNF-α

11、，而龍芩草噴霧劑能夠抑制TNF-α的異常增加；龍芩草噴霧劑中劑量組對(duì)氨水引咳的小鼠的咳嗽次數(shù)明顯減少，并與空白組相比較，具有極顯著差異(p＜0.01)，其他各組無明顯改變(P＞0.05)；正常對(duì)照組大鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2的表達(dá)較低，肺組織內(nèi)可見散在的TNF-α、IL-6、IL-2陽性細(xì)胞，油酸所致急性肺損傷模型大鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2的表達(dá)明顯增高，肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2陽性細(xì)胞較多

12、，呈強(qiáng)表達(dá)，陽性藥組、龍芩草噴霧劑大、中劑量組能明顯降低油酸所致急性肺損傷模型大鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2的表達(dá)，肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2陽性細(xì)胞較模型組明顯減少，表達(dá)減弱，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或0.01)，小劑量組降低不明顯；甲(A1)型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM-1經(jīng)小鼠噴霧感染測(cè)定其半數(shù)致死量(LD50)為10-3.68，小鼠對(duì)龍芩草噴霧劑最大耐受量為臨床用量的100倍，對(duì)于小鼠死亡的保

13、護(hù)作用，除給藥組的0.825g/kg劑量組(P＞0.05)外，其它劑量組(1.65g/kg、3.3g/kg、6.6g/kg)均有顯著性差異(P＜0.01)。 (5)龍芩草噴霧劑家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：二種給藥途徑都大約在70min時(shí)血藥濃度達(dá)峰值，且經(jīng)口、鼻腔給藥的峰值時(shí)的血藥濃度是灌胃給藥的1.6倍，口、鼻腔給藥相對(duì)于灌胃給藥的相對(duì)生物利用度為166.5％，霧化給藥后，口、鼻腔粘膜中測(cè)到含有黃芩苷成分。 (6)毒理學(xué)試

14、驗(yàn)顯示，龍芩草噴霧劑、口含片高、中、低劑量組合組織臟器均無明顯病理變化，可以認(rèn)為無毒。 (7)通絡(luò)救腦口服微乳制備工藝：確定梔子提取工藝的各種參數(shù)，得到空微乳三相最佳比例為吐溫-丙二醇-肉豆蔻酸異丙酯-水(9：3：1：30)，得到口服微乳的制劑成型工藝。 (8)通絡(luò)救腦口服微乳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：確定了薄層色譜方法；規(guī)定了檢查項(xiàng)目；制定了制劑梔子苷含量限度，每5ml樣品梔子苷含量不低于45mg，實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察均符合要求。

15、(9)通絡(luò)救腦口服微乳穩(wěn)定性試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)室留樣觀察三月，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目檢查，包括外觀、鑒別、檢查、含量測(cè)定、衛(wèi)生學(xué)，均符合規(guī)定。 (10)通絡(luò)救腦口服微乳生物利用度的測(cè)定：以人參皂苷Rg1為指標(biāo)，家兔口服三七總皂苷微乳液、水溶液，與耳緣靜脈注射血栓通注射液相比較，結(jié)果為注射液血藥濃度峰值出現(xiàn)在給藥后5min，然后逐漸衰減，速率較快；微乳灌胃給藥后10min，血藥濃度達(dá)峰值，然后逐漸衰減，速率較注射液慢；水溶液只在10、15min時(shí)

16、間點(diǎn)測(cè)得，且濃度不高。測(cè)得口服微乳的生物利用度為62.17％。 4結(jié)論 綜上兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)提取地龍、黃芩、甘草；梔子、三七有效部位，制成龍芩草噴霧劑、龍芩草口含片；通絡(luò)救腦口服微乳，基本達(dá)到中藥現(xiàn)代制劑的“三小”、“三效”、“五方便”要求。龍芩草噴霧劑、口含片具有清肺利咽，解毒瀉熱功效，用于病毒感染所致的流感，上呼吸道感染作用顯著，經(jīng)口、鼻腔粘膜給藥，避免肝臟首過效應(yīng)的影響，顯著提高生物利用度；通絡(luò)救腦口服微乳具有涼