糖耐量受損對(duì)心肌功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的
　　 糖耐量受損(impaired glucose tolerance,IGT)是糖尿病前期(pr-diabetes)狀態(tài)主要表現(xiàn),是糖尿病病前的一種過(guò)渡狀態(tài),各種類(lèi)型糖尿病的一個(gè)關(guān)鍵發(fā)展階段。糖耐量受損能破壞體內(nèi)糖代謝平衡,成為Ⅱ型糖尿病和增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要誘因。心肌功能降低是糖耐量受損階段中發(fā)生的心血管損傷之一。同時(shí)長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)并伴隨炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá),增加糖耐量受損發(fā)展階段心血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病

2、.心血管疾病.炎癥之間的關(guān)系復(fù)雜,闡明其相互作用對(duì)于代謝性心肌功能損傷的防治具有重要的臨床意義。
　　 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作為一個(gè)重要的促炎因子,在心血管疾病和糖尿病等疾病患者相關(guān)組織中表達(dá)異常增加,而在代謝性心肌病(metabolic cardiomyopathy)發(fā)病機(jī)制中是否發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有待深入研究。已知G蛋白偶聯(lián)受體激酶-2(G p

3、rotein coupled-receptor kinase 2,GRK2)是心肌病變的早期標(biāo)記分子,c-jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡和慢性炎癥相關(guān)。因此揭示MIF與GRK2、JNK之間的關(guān)系,能初步闡明糖尿病前期糖耐量受損狀態(tài)心肌功能降低的病理生理學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 本研究在建立糖耐量受損大鼠模型的基礎(chǔ)上,探討糖耐量受損狀態(tài)對(duì)大鼠的心肌功能、糖代謝、炎癥因子以及凋

4、亡相關(guān)信號(hào)通路的影響；同時(shí)以高濃度葡萄糖模擬糖耐量受損的餐后高血糖因素,建立高濃度葡萄糖條件心肌凋亡模型。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證糖耐量受損的高血糖因素致心肌細(xì)胞凋亡作用,并探討MIF是否參與此凋亡過(guò)程,以及MIF與GRK2、JNK之間的可能調(diào)控形式。
　　 方法
　　 利用低劑量鏈脲霉素(20 mg/kg)誘導(dǎo)建立糖耐量受損大鼠模型,0、2、4、6 wk進(jìn)行大鼠空腹血糖測(cè)定和口服糖耐量試驗(yàn),計(jì)算餐后血糖水平曲線下面積,評(píng)價(jià)

5、大鼠的糖耐量水平；實(shí)驗(yàn)6wk,利用超聲心動(dòng)圖測(cè)定各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)和左室收縮分?jǐn)?shù)等主要指標(biāo),反映心肌功能情況。6wk后,處死各組大鼠,制作心肌組織石蠟切片或提取心肌組織總蛋白。石蠟切片以糖原過(guò)碘酸雪夫堿PAS染色,光學(xué)顯微鏡觀察心肌糖原或糖基化物質(zhì)沉積情況；同時(shí)石蠟切片以末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色,光學(xué)顯微鏡觀察分析糖耐量受損狀態(tài)的致凋亡情況；以western blotting檢測(cè)caspase-3分解活性片

6、段、炎癥因子MIF、心肌功能異常標(biāo)記分子GRK2和磷酸化JNK在心肌組織的表達(dá)情況。
　　 體外實(shí)驗(yàn)部分中,25mM D-葡萄糖作為高濃度糖實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)條件,模擬糖耐量受損狀態(tài)的餐后高糖血癥病理?xiàng)l件,建立心肌細(xì)胞凋亡模型,而5mM D-葡萄糖作為正常對(duì)照組或心肌細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的本底對(duì)照。以人源性成心肌細(xì)胞株AC16作為主要的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)時(shí)以低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞,然后正常組和實(shí)驗(yàn)組分別加入葡萄糖原液,使葡萄糖終濃度分別為

7、5和25 mM。
　　 通過(guò)熒光顯微鏡觀察,以DCFH-DA熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生水平,評(píng)價(jià)高濃度葡萄糖的氧化應(yīng)激壓力作用,同時(shí)以JC-1熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位,評(píng)價(jià)高濃度葡萄糖的促凋亡作用,并以此作為高濃度葡萄糖氧化應(yīng)激和致凋亡作用的定性分析。
　　 為了模擬和驗(yàn)證糖耐量受損狀態(tài)的餐后高糖血癥對(duì)MIF、GRK2和JNK的直接調(diào)控作用,AC16細(xì)胞加入25 mM高濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)20、30和

8、60 min后,然后經(jīng)蛋白裂解液裂解,提取總蛋白,通過(guò)western blotting檢測(cè)MIF、GRK2蛋白表達(dá)和JNK磷酸化水平；同時(shí)25 mM高濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)AC16細(xì)胞60 min時(shí),以TRIZOL裂解細(xì)胞,提取總RNA,并以realtime-PCR檢測(cè)MIF和GRK2 mRNA表達(dá)水平。
　　 AC16細(xì)胞以JNK磷酸化抑制劑-SP600125(2.5 μM)、MIF互變異構(gòu)酶活性拮抗劑-ISO-1(40 μM)

9、或二甲亞砜(DMSO:0.1％)預(yù)處理1 h,然后以25mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)72h,以明確MIF和JNK在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行AnnexinV-FITC/PI雙染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度,數(shù)據(jù)通過(guò)處理,在二維圖右下象限中計(jì)算細(xì)胞早期凋亡率；或經(jīng)細(xì)胞蛋白裂解液裂解,提取總蛋白,以western blotting檢測(cè)caspaSe-3活性分解片段。
　　 以SP600125作為抑制

10、JNK磷酸化活性的陽(yáng)性對(duì)照,利用ISO-1抑制MIF互變異構(gòu)酶活性,明確心肌細(xì)胞在高濃度葡萄糖條件下內(nèi)源性MIF對(duì)JNK磷酸化活性的調(diào)控作用；AC16細(xì)胞以SP600125、ISO-1或二甲亞砜預(yù)處理1 h后,以25 mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)30、60 min,然后以細(xì)胞全蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞,以western blotting檢測(cè)JNK磷酸化水平。同時(shí)利用ISO-1明確心肌細(xì)胞在高濃度葡萄糖條件下MIF互變異構(gòu)酶活性對(duì)

11、GRK2表達(dá)的調(diào)控作用,AC16細(xì)胞以ISO-1或二甲亞砜預(yù)處理1h后,以25 mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)60 min,然后裂解細(xì)胞,提取總蛋白,western blotting檢測(cè)GRK2表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 大鼠經(jīng)鏈脲霉素注射后,在各時(shí)間點(diǎn)空腹血糖水平與正常組之間差異不顯著。2、4、6 wk的口服糖耐量試驗(yàn)中,模型組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)糖耐量異常,其中血糖水平曲線下面積比正常對(duì)照組高,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)以往報(bào)道糖

12、尿病前期狀態(tài)糖耐量受損的血糖水平曲線下面積特征(比正常組高15-40％),在0、2、4、6 wk模型組大鼠血糖水平曲線下面積分別增加2.50％、16.28％、38.60％和38.61％,因此它們可以認(rèn)為發(fā)生糖耐量受損。
　　 另外模型組和正常組超聲心動(dòng)圖指標(biāo)左室射血分?jǐn)?shù)和左室收縮分?jǐn)?shù)分別為68.59±6.62％Vs 81.40±5.34％(t=4.020,p=0.002)、33.74±4.91％vs 44.60±5.11％(t=

13、3.941,p=0.002),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此糖耐量受損的大鼠出現(xiàn)心肌功能降低。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色和caspase-3western blotting檢測(cè),表明糖耐量受損狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)凋亡心肌細(xì)胞。同時(shí)糖原過(guò)碘酸雪夫堿PAS染色顯示糖原或糖基化物質(zhì)沉積在糖耐量受損大鼠的心肌組織,其中在血管周?chē)M織的沉積明顯。這些說(shuō)明糖耐量受損具有一定的心臟糖毒性作用。另外,糖耐量受損大鼠的心肌組織中炎癥因子-M

14、IF和心肌病變標(biāo)記分子-GRK2表達(dá)水平增加,JNK 通路激活。
　　 體外實(shí)驗(yàn)部分中,DCFH-DA熒光探針顯示心肌細(xì)胞在高濃度葡萄糖作用下,胞內(nèi)活性氧簇在24h開(kāi)始明顯增強(qiáng),表明高濃度葡萄糖具有強(qiáng)的氧化應(yīng)激作用；同時(shí)JC-1探針熒光顯示高濃度葡萄糖降低心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位,能觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。另外,高濃度葡萄糖促進(jìn)AC16心肌細(xì)胞MIF、GRK2表達(dá)和JNK磷酸化水平增加。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果吻合,說(shuō)明高濃度葡萄糖致心肌凋

15、亡模型可以用于驗(yàn)證糖耐量受損高血糖因素的心臟糖毒性作用。高濃度葡萄糖同時(shí)促進(jìn)MIF和GRK2 mRNA表達(dá)水平增加。
　　 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)AC16心肌細(xì)胞72 h凋亡率為11.536±1.442％,而經(jīng)過(guò)SP600125或ISO-1預(yù)處理后,.AC16心肌細(xì)胞凋亡率分別下降至6.116±0.337％和5.776±1.217％(F=53.347,P<0.001),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高濃度葡萄糖作用72 h能激活A(yù)C16心肌細(xì)

16、胞caspase 3,而經(jīng)過(guò)SP600125或ISO-1預(yù)處理均使AC16心肌細(xì)胞caspase 3活化分解片段表達(dá)降低(F=20.169,P<0.001),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明高濃度葡萄糖可以通過(guò)MIF的互變異構(gòu)酶活性和JNK磷酸化途徑介導(dǎo)AC16心肌細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 低劑量鏈脲霉素可建立糖耐量受損大鼠模型。糖耐量受損引起大鼠心肌功能降低和糖代謝異常,同時(shí)心肌組織存在炎癥和凋亡細(xì)胞,表明糖耐量受損具

17、有一定的心臟糖毒性作用。
　　 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,能在一定程度說(shuō)明糖耐量受損大鼠模型心肌功能降低的機(jī)制?；铙w實(shí)驗(yàn)中Caspase-3、MIF和磷酸化JNK的異常表達(dá)在體外心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證,可能參與了心肌功能降低的病理過(guò)程,GRK2的表達(dá)能作為糖耐量受損心肌功能降低的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。MIF的互變異構(gòu)酶活性在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、GRK2表達(dá)和JNK磷酸化中具有重要的調(diào)控作用。因此MIF可能是代謝性心肌病的一個(gè)關(guān)